原核生物基因表达与操作
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原核生物基因表达与操作
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
重组基因的原核生物表达 体系与产物的分离纯化
原核生物基因表达与操作
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增原，核生物获基因表得达与子操作 代DNA
原核生物基因表达与操作
重组基因表达的目的
1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产原。核生物基因表达与操作
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
原核生物基因表达与操作
常用的可调控启动子
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控 元件控制外源基因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框架(ORF)。
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
原核生物基因表达与操作
➢ 原核生物基因表达载体的组成特征
启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
原核生物基因表达与操作
常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体 1）强启动子: tac（trp-lac） trp的-35区
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统
lac操纵基因
3）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
原核生物基因表达与操作
条件： 必须选择一个有
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
原核生物基因表达与操作
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
原核生物基因表达与操作
重组基因表达体系
1. 原核体系
➢大肠杆菌 ➢枯草杆菌 ➢乳酸菌
➢沙门氏杆菌 ➢苏云金杆菌
➢酵母细胞
2. 真核体系 ➢昆虫细胞
➢植物细胞、组织 原核生物基因表达与操作➢动物细胞、组织
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
➢ 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 ➢ 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降
解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。
原核生物基因表达与操作
2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
原核生物基因表达与操作
➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌表达载体
核糖体结合位点
启动子
转录终止子
原核生物基因表达与操作
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编 码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单 元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤 光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙 酰转移酶基因等）。
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否 已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也 可用来同任何一种目的启动子连接，因此其 表达活性可作为检测启动子功能的依据。
lacI的宿主菌。百度文库
原核生物基因表达与操作
非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任 何其他氨基酸。 所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起 始，在其氨基端不含细菌多肽序列。
原核生物基因表达与操作
非融合蛋白特点：
➢ 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。
1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
原核生物基因表达与操作
➢重组基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导 宿主菌的酶系统合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必 须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。
和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳
糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
重组基因的原核生物表达 体系与产物的分离纯化
原核生物基因表达与操作
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增原，核生物获基因表得达与子操作 代DNA
原核生物基因表达与操作
重组基因表达的目的
1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产原。核生物基因表达与操作
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
原核生物基因表达与操作
常用的可调控启动子
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控 元件控制外源基因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框架(ORF)。
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
原核生物基因表达与操作
➢ 原核生物基因表达载体的组成特征
启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
原核生物基因表达与操作
常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体 1）强启动子: tac（trp-lac） trp的-35区
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统
lac操纵基因
3）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
原核生物基因表达与操作
条件： 必须选择一个有
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
原核生物基因表达与操作
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
原核生物基因表达与操作
重组基因表达体系
1. 原核体系
➢大肠杆菌 ➢枯草杆菌 ➢乳酸菌
➢沙门氏杆菌 ➢苏云金杆菌
➢酵母细胞
2. 真核体系 ➢昆虫细胞
➢植物细胞、组织 原核生物基因表达与操作➢动物细胞、组织
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
➢ 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 ➢ 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降
解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。
原核生物基因表达与操作
2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
原核生物基因表达与操作
➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌表达载体
核糖体结合位点
启动子
转录终止子
原核生物基因表达与操作
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编 码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单 元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤 光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙 酰转移酶基因等）。
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否 已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也 可用来同任何一种目的启动子连接，因此其 表达活性可作为检测启动子功能的依据。
lacI的宿主菌。百度文库
原核生物基因表达与操作
非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任 何其他氨基酸。 所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起 始，在其氨基端不含细菌多肽序列。
原核生物基因表达与操作
非融合蛋白特点：
➢ 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。
1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
原核生物基因表达与操作
➢重组基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导 宿主菌的酶系统合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必 须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。
和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳
糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
原核生物基因表达与操作
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构