猪常见传染病的PCR诊断引物

一、猪繁殖与呼吸障碍综合征

1、引物序列

N-U:5′-GCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGG-3′；

N-L:5′-GCGTCGGCAAACTAAACTCCACAG-3′

2、预期扩增片断长度为309bp，

3、反应条件：95℃预变性5min 后，进行如下循环：94℃，30sec；

57℃，30sec；72℃，50sec，35 个循环。72℃延伸30min。

二、猪圆环病毒

1、引物序列：

唐万寿等. 猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其应用[J]. 动物医学进展.2008，29 (6):54-57

P1:5’-GAGTCTGGTGACCGTTGC-3’

P2:5’-TTCCTCCGTGGATTGTTC-3’ (493bp)

95℃5min, 94℃50s,52℃50,72℃50s,35循环，72℃10 min

2、扩增目的片段大小为

3、反应条件：

体系：

10×buffer 2.5

dNTP(2.5mM) 2

引物P1(50pmo l/μL)0.5

引物P2(50pmol/μL)0.5

r-Taq (5U/μL)0.2

ddH2O 16.3

DNA模板 3

Total 25

三、猪瘟

1引物序列：猪瘟

CSFV1:5’-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3’

CSFV2:5’-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3’

2片段大小：507bp

3反应条件：

采用100 L反应体系, 在20 L cDNA 产物管中加入 6 L

25 mmol/ L MgCl2 , 8 L 10 PCR 缓冲液, 100 pmol/ L引物XZ98

和引物XZ99 各1 L, 0 5 L 5 U/ L Taq DNA 聚合酶, 用无菌

水加至总体积为100 L。置PCR 仪上, 首先94 变性 5 min;

然后94 变性1 min, 60 退火1 min, 72 延伸 1 min, 循环35

次; 最后72 延伸10 min, 于4 结束反应。

四、猪伪狂犬病

PRV1:5‘一GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT一3‘，

PRV2:5‘一CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA一3

PcR反应如下:

10×buffers 5μl

MgCL2(25mmol/L) 5μl

dNTPs(25nunol/L) 4μl

ExTaqase(SUI林L) 0.3μl

P1 0.5μl

P2 0.5μl

DNA 2μl

ddH2O 32.7μl

total 50μl

94℃预变性5min，随后作如下循环:94℃30s，57℃30s，72℃1min，

共25个循环，循环结束后72℃延伸5min。

五、细菌性疾病主要有猪链球菌病

1引物：

根据GenBank 中已登录的cps2J(GenBank 登录号：AF118389)、mrp(GenBank 登录号：A24025)、ef(GenBank 登录号：A24023)三个基因，利用Primer primer 5 设计引物：

cps2J 的引物为：

SS1：5’- GATAGATGACGGTTCTTCAGATT-3’

SS2：5’- TCCTCTCCTAACCACTGTTCAG-3’

2片段大小：分别为，450bp

3体系：采用25 μL 反应体系，反应过程为：cps2J 的扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性 1 min，54℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，32 个循环，72℃延伸10 min；mrp 和ef的扩增条件为：94℃预变性 5 min，94℃变性 1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，32 个循环，72℃延伸10 min

六、副猪嗜血杆菌病、

1引物：

HPs1:5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’

HPs2:5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’

2大小：822bP

3体系：PCR 扩增体系25 μL, 10×buffer 2.5 μL，

dNTP 2.5 mmol/L 2.5μL，Mg2+

25 mmol/L 2.0 μL、上下游引物20 μmol/L 各

0.5 μL

Taq 酶1.5 U

DNA 模扳200~400 ng

最后加灭菌蒸馏水至25 μL.

程序：94℃预变性 5 min；94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃45s，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min.

七、猪喘气病

1、引物序列

MPS1:5`CCAGGATGCACAAAATAACTG3`

MPS2: 5`ACCCGAAGAACTTCAACAGC3`

2、扩增片段长约795 bp，

3、反应条件

体系：

10×buffer 2.5μL

dNTP 2μL

MgCl2（25mmol/L） 1.5μL

引物1μL

模板0.25μL

灭菌三蒸水16.5μL

TaqDNA 聚合酶0.25μL

以上各种液体混匀后，放入PCR 仪中扩增。

程序：为94℃5min；然后94℃1min，52 ℃1min，72℃2min，共30 个循环；最后再以72℃延伸10min。

八、猪传染性胸膜肺炎

1、引物序列

App1:5‘-AAGGTTGATATGTCCGCACC-3 ‘;

App2:5‘-CACCGATTACGCCTTGCCA-3’。

2、预期扩增的目的片段大小为450bp

3、反应条件

扩增长度为952 bp。PCR扩增条件

优化后,采用25μL反应体系:10×PCR缓冲液2.5

μL,dNTPs (0. 2 mmol/L) 2μL,上游引物P1(10pmol/μL) 0.5μL,下游引物P2(10 pmol/μL)

0.5μL,TaqDNA聚合酶0.25μL,模板DNA 2

μL,ddH2O 17.25μL。

PCR反应程序为: 95℃3min;94℃30 s,60℃30 s, 72℃40 s,共35个循环;最后72℃延伸10 min。

猪巴氏杆菌病

吴秀芬等. 二联PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌[J]. 黑龙江畜牧兽医.2007,3 PAS1:5’-AGGGCACGCAGGCGGACTTTTA-3’

PAS2:5’-ATCGACAGCGTTTACAGCGTGGA-3’（253bp）

94℃5min, 94℃40s,56.5℃1min,72℃1min,30循环，72℃10 min

猪流行性感冒

吕翠等. RT-PCR技术检测猪流感病毒. 中国农学通报[J].2008,24(10)

SIV1:5’-CTGGTGCACTTGCCAGTTGC-3’

SIV2:5’-GATCAAGAA TCCACAATATC-3’(460bp)

94℃5min, 94℃30s,55℃40s,72℃1min,30循环，72℃10 min