遗传工程动物模型20201019
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1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因 敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直 接、最有效的方法之一。
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱 导型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物 个体中的靶基因活性。
随机整合
每个首代转基因小鼠的子代都需要进行 转基因遗传和表达的检测。由于不同的 整合位点和拷贝数，每一个首代转基因 小鼠可以有不同的表达水平。
在有些首代小鼠中，转 基因可能整合到多个位 点上，导致超过50%的 遗传频率。在这种情况 下，第一代子代的表达 水平不同，依赖于他们 遗传了哪个整合位点。 这可能是由减数分裂重 组如染色体双交换的结 果。
（三）反转录病毒法 （四）精子载体法
细 胞 核 移 植 法
四 转基因动物的意义
• 转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发 展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的 方法来研究；
• 基因表达有时空与组织的特异性； • 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调
控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究 基因的表达、调控及基因之间的相互作用。
4. 82年以后，转基因技术得到了大力的推广和研究， 至今已制备出小鼠、大鼠、鸡、兔、猪、羊、鱼等转 基因品系。
一 、概 念
通过实验手段将外源遗传物质导入到动物生 殖细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称 为转基因动物。
遗传改变：
✓ 外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结 构发生改变； ✓ 外源DNA的插入使染色体发生重排； ✓ 导入可以持久存在的遗传实体。
绝缘子与外源基因表达
PLUSGENE
P无绝缘子TYR转基因小鼠
FVBN为阴性对照（纯白），显示，无绝 缘子时基因表达为25%
含HS4绝缘子TYR转基因小鼠
FVBN为阴性对照（纯白），有绝缘子表 达为100%
EcoRI (78 8 1 )
I CEU-I CSH4 primer 2XCSH4
M13-47
通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因 功能的动物后代。
1. 必备条件
✓胚胎干细胞(ES细胞)
• 能在体外培养，保留发育的全能性
✓外源目的基因 ✓打靶载体
• Neo（新霉素）阳性筛选标志 • HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex
virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)
4. 应 用
✓基因特异表达的研究 ✓发现基因的新功能 ✓发现新基因 ✓建立基因表达、调控的动物模型 ✓建立人类疾病的动物模型等
体 细 胞 克 隆
（二）胚胎干细胞（ES）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培 养建立起来的多潜能细胞系。
将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的 早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。
PLUSGENE
PROFESSIONAL TRANSGENIC CENTER
转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
1 of 10
如何繁殖首代转基因小鼠？
目的基因随机整合到基 因组，因此首代转基因 小鼠将会有不同的整合 位点。整合基因的拷贝 数可能在不同的首代转 基因小鼠中也不同。由 于这些原因，每一个首 代转基因小鼠需要作为 一个独立的谱系对待并 且与其它首代转基因小 鼠分开来进行繁殖。
1. 程序 ✓准备假孕母鼠 ✓受精卵的准备 ✓基因导入 ✓胚胎移植 ✓对幼鼠的鉴定
PMSG
2. 优 点：
✓外源DNA大小基本不受限制（1～200kb）； ✓导入过程直观； ✓整合率高
3. 缺 点：
✓设备昂贵、环节较多 ✓对操作人员有较高的技术要求 ✓低效率（尤其是大家畜） ✓对卵子伤害大，胚胎存活率低 ✓基因整合随机性 ✓转基因沉默
组织特异性表达
PLUSGENE
DDX-ERT2-CRE-ERT2S可诱导型睾丸特异表达小鼠模型
可诱导型DDX4-ERT2_CRE_ERT2转基因小鼠与FLOX-LAZ小鼠 效配后，诱导显示，在诱导后可成功地进行同源重组，并靛 LAZ
左图为阴性对照睾丸染色，左图为诱导后LAZ染色
肾脏染色无非特异性表达
转基因的表达与整合到小鼠基因组上的拷贝数相关，拷贝数越高，表达 水平越高，因此越多的FOUNDER, 越有利于得到高表达转基因小鼠，我们合 同上提供5只，平均已达到10只以上，足够找到高表达的转基因小鼠。 图中括号内为整合拷贝数。
不同启动子在不同细胞中表达效率不一致
YOU LIKE IT? CONTACT ME!
2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射 法获得SV40DNA转基因小鼠。
3. 1982年Palmiter成功获得了含金属巯基(MTI)基因 启动子与大鼠生长基因（Growth Hormone）的融合基 因的转基因小鼠。体重远大于正常对照，被称为“超 级小鼠” (Supermice)。
持混合背景。
首代小鼠不同用
i 首建鼠因整合背景复杂，不同用作研 究，必须至少传至F1或F2代后，方可用 于研究，可用定量PCR或Sonthern杂交来 区分遗遗传背景，检测是否为杂合子还 是纯合子。或者可将疑似纯合子的小鼠 与野生型小鼠杂交并检测所有的子代来 看它们是否为杂合子
三 、基本方法
• 显微注射法 • 胚胎干细胞法
(embryonic stem cells，ES细胞) • 逆转录病毒感染法 • 精子载体法 • 细胞核移植
（一）雄原核显微注射法
以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建 好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射 的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物 个体。
目前应用较广泛，最早最经典的方法。
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源 打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地 整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在 体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于10-6），增加了实际操作的工 作量，限制了该项技术的应用。
不同启动子的表达不同，因此启动子的先择将直接影响转基因小鼠的表达, 我们已成功使用CAG和UBC启动子获得了全身高效表达的转基因小鼠。值得 注意的是，在不同的组织中同一启动子表达效率有可能是不一样的。
全身表达
PLUSGENE
肥胖小鼠模型 启动子为CAG
%
荧光小鼠模型
荧光小鼠模型
转基因GFP小鼠,启动子为CAG，显示可 以有效地全身表达，左图为腹部荧光成 像，右图为内脏荧光成像。
遗传工程动物模型
2020/10/28
1
• 实验 动物
在临
床疾
病研
究中
的地 位
疾病
动物模 型
诊断与 治疗
模式动物面临的问题？
不同的模式动物与人表型并不一致 基因的表达模式不同 临床上疾病多为点突变
第一节 概述
由结构基因组转向功能基因组的研究，大规模、系统地研 究基因功能及其在生理和病理过程中的作用,遗传工程动物 模型是必不可少的研究工具。
• 显微注射法 • 胚胎干细胞法
(embryonic stem cells，ES细胞) • 逆转录病毒感染法 • 精子载体法 • 细胞核移植 • ENU诱变
第二节 转基因动物
1. 20世纪60年代末和70年代初，John Gurdon向蛙卵 和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能否在动物卵细胞和 早期胚胎中翻译。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和 空间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动 物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进 行敲除的技术。
表达水平不同
任何获得的首代小鼠的转基因可能不遵 照孟德尔遗传方式。如果整合发生在第 一个细胞分裂以后，首代小鼠的转基因 可能是嵌合的。嵌合可以导致在第一代 子代中遗传频率低于50%
如果卵子供者为近交 系（例如，C57），首 代小鼠应该与背景相 同的小鼠进行繁殖以 保持纯系的特性。对 于来自杂合的FVB/ C57 品种的首代小鼠，客 户必须决定是与一个 纯系进行回交还是维
2. 基本程序
✓打靶载体的构建 ✓打靶载体导入ES细胞：重组置换 ✓基因敲除ES细胞注射入胚泡 ✓胚泡植入假孕小鼠的子宫中 ✓嵌合体的杂交育种
Injection of ES cells into blastocysts
3. 优 点
✓外源基因整合情况的可控性高。 ✓可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、
表达的水平及插入的稳定性。 ✓外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛
选方便。
4. 缺 点
✓ES细胞系建立及培养困难 ✓维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 ✓所得个体为嵌合体
目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较 成熟，在大动物上应用较晚。
5. 在医学中的应用
✓遗传病研究 ✓肿瘤的研究 ✓生物制药
➢ 进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体 水平的表现调控规律。
➢ 转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性 研究。
➢ 也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。 ➢ 还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物
质。
第三节 基因定位突变动物模型
基因敲除
1 非条件型基因敲除 2 条件型基因敲除
• 按目的片断性质分
• ORF • 小分子RNA • cre
关键因素
• DNA concentration • Injection buffer • Visualizing pronuclei • Timing of injection • Size of DNA • Copy number ： 随机的 • Position Effect insulator
2XCSH4
双绝缘子HS4载体
转基因小鼠的外源基因是随机插入的小 鼠基因组上的，插入位置会对外源基因 的表达产生致命性的影响，我们构建的 CH4绝缘子可最大程度上减少插入位置 对基因的影响。
转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
拷贝数与转基因小鼠中基因表达的关系
YOU LIKE IT? CONTACT ME!
二 、 基本原理
➢目的基因：显微注射 受精卵或胚胎细胞 整合 植入输卵管
➢外源基因：顺式作用元件 结构基因 报告 基因(report gene) 融合基因
ZRS promoter
CDS
Poly A
转基因策略
• 按类型分：
• 全身表达： CAG, BACTIN, UBC,EIIa • 可诱导表达: TET ,ERT2 • 组织特异性表达
Ampicillin
CSH4 primer ES-1R3
BamHI (5291 )
pNCHS4 final empty
7885 bp
Rep(pMB1)
Kpn I (528 3)
AgeI (5243)
PUC-R
EcoRI (51 76)
I CEU-I
M luI (51 32)
CSH4 PRIMER
CSH4 PRIMER
一、 定 义
运用各种技术手段有目的地干预动物的遗传组 成，导致动物新的性状的出现，并使其能有效地遗 传下去，形成新的可供生命科学研究和其他目的所 用的动物模型，这类动物可被称为遗传工程动物模 型。
二 、 技术手段
➢ 显微注射转基因技术 ➢ 基因定位突变技术 ➢ 化学或放射诱变技术
三 、基本方法
绝缘子与外源基因在基因组整合示意图
我们设计的HS4载体（见前图），具有三大优点： 1. 二侧含I-CEU I,酶切位点，该序列用单酶切，因为具有28个识别碱基，90以上的基因均不含此酶切位点；2
该酶切位点产生的粘性未端四个碱基为非对称的，因此可以定向连接产生串连多拷贝，有文献报道在转 基因小鼠中可产生最多可产生36个拷贝。 3. HS4为本身为对向双绝子，在产生多拷贝串联时，每个表达区间具有四个绝缘子间隔，可将插入位点的影 响降至最低。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高 度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的 所有组织，并且在不同的培养条件下表现出 不同的功能状态。
源自文库
在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录
病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共 沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种 不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱 导型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物 个体中的靶基因活性。
随机整合
每个首代转基因小鼠的子代都需要进行 转基因遗传和表达的检测。由于不同的 整合位点和拷贝数，每一个首代转基因 小鼠可以有不同的表达水平。
在有些首代小鼠中，转 基因可能整合到多个位 点上，导致超过50%的 遗传频率。在这种情况 下，第一代子代的表达 水平不同，依赖于他们 遗传了哪个整合位点。 这可能是由减数分裂重 组如染色体双交换的结 果。
（三）反转录病毒法 （四）精子载体法
细 胞 核 移 植 法
四 转基因动物的意义
• 转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发 展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的 方法来研究；
• 基因表达有时空与组织的特异性； • 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调
控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究 基因的表达、调控及基因之间的相互作用。
4. 82年以后，转基因技术得到了大力的推广和研究， 至今已制备出小鼠、大鼠、鸡、兔、猪、羊、鱼等转 基因品系。
一 、概 念
通过实验手段将外源遗传物质导入到动物生 殖细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称 为转基因动物。
遗传改变：
✓ 外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结 构发生改变； ✓ 外源DNA的插入使染色体发生重排； ✓ 导入可以持久存在的遗传实体。
绝缘子与外源基因表达
PLUSGENE
P无绝缘子TYR转基因小鼠
FVBN为阴性对照（纯白），显示，无绝 缘子时基因表达为25%
含HS4绝缘子TYR转基因小鼠
FVBN为阴性对照（纯白），有绝缘子表 达为100%
EcoRI (78 8 1 )
I CEU-I CSH4 primer 2XCSH4
M13-47
通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因 功能的动物后代。
1. 必备条件
✓胚胎干细胞(ES细胞)
• 能在体外培养，保留发育的全能性
✓外源目的基因 ✓打靶载体
• Neo（新霉素）阳性筛选标志 • HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex
virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)
4. 应 用
✓基因特异表达的研究 ✓发现基因的新功能 ✓发现新基因 ✓建立基因表达、调控的动物模型 ✓建立人类疾病的动物模型等
体 细 胞 克 隆
（二）胚胎干细胞（ES）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培 养建立起来的多潜能细胞系。
将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的 早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。
PLUSGENE
PROFESSIONAL TRANSGENIC CENTER
转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
1 of 10
如何繁殖首代转基因小鼠？
目的基因随机整合到基 因组，因此首代转基因 小鼠将会有不同的整合 位点。整合基因的拷贝 数可能在不同的首代转 基因小鼠中也不同。由 于这些原因，每一个首 代转基因小鼠需要作为 一个独立的谱系对待并 且与其它首代转基因小 鼠分开来进行繁殖。
1. 程序 ✓准备假孕母鼠 ✓受精卵的准备 ✓基因导入 ✓胚胎移植 ✓对幼鼠的鉴定
PMSG
2. 优 点：
✓外源DNA大小基本不受限制（1～200kb）； ✓导入过程直观； ✓整合率高
3. 缺 点：
✓设备昂贵、环节较多 ✓对操作人员有较高的技术要求 ✓低效率（尤其是大家畜） ✓对卵子伤害大，胚胎存活率低 ✓基因整合随机性 ✓转基因沉默
组织特异性表达
PLUSGENE
DDX-ERT2-CRE-ERT2S可诱导型睾丸特异表达小鼠模型
可诱导型DDX4-ERT2_CRE_ERT2转基因小鼠与FLOX-LAZ小鼠 效配后，诱导显示，在诱导后可成功地进行同源重组，并靛 LAZ
左图为阴性对照睾丸染色，左图为诱导后LAZ染色
肾脏染色无非特异性表达
转基因的表达与整合到小鼠基因组上的拷贝数相关，拷贝数越高，表达 水平越高，因此越多的FOUNDER, 越有利于得到高表达转基因小鼠，我们合 同上提供5只，平均已达到10只以上，足够找到高表达的转基因小鼠。 图中括号内为整合拷贝数。
不同启动子在不同细胞中表达效率不一致
YOU LIKE IT? CONTACT ME!
2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射 法获得SV40DNA转基因小鼠。
3. 1982年Palmiter成功获得了含金属巯基(MTI)基因 启动子与大鼠生长基因（Growth Hormone）的融合基 因的转基因小鼠。体重远大于正常对照，被称为“超 级小鼠” (Supermice)。
持混合背景。
首代小鼠不同用
i 首建鼠因整合背景复杂，不同用作研 究，必须至少传至F1或F2代后，方可用 于研究，可用定量PCR或Sonthern杂交来 区分遗遗传背景，检测是否为杂合子还 是纯合子。或者可将疑似纯合子的小鼠 与野生型小鼠杂交并检测所有的子代来 看它们是否为杂合子
三 、基本方法
• 显微注射法 • 胚胎干细胞法
(embryonic stem cells，ES细胞) • 逆转录病毒感染法 • 精子载体法 • 细胞核移植
（一）雄原核显微注射法
以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建 好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射 的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物 个体。
目前应用较广泛，最早最经典的方法。
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源 打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地 整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在 体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于10-6），增加了实际操作的工 作量，限制了该项技术的应用。
不同启动子的表达不同，因此启动子的先择将直接影响转基因小鼠的表达, 我们已成功使用CAG和UBC启动子获得了全身高效表达的转基因小鼠。值得 注意的是，在不同的组织中同一启动子表达效率有可能是不一样的。
全身表达
PLUSGENE
肥胖小鼠模型 启动子为CAG
%
荧光小鼠模型
荧光小鼠模型
转基因GFP小鼠,启动子为CAG，显示可 以有效地全身表达，左图为腹部荧光成 像，右图为内脏荧光成像。
遗传工程动物模型
2020/10/28
1
• 实验 动物
在临
床疾
病研
究中
的地 位
疾病
动物模 型
诊断与 治疗
模式动物面临的问题？
不同的模式动物与人表型并不一致 基因的表达模式不同 临床上疾病多为点突变
第一节 概述
由结构基因组转向功能基因组的研究，大规模、系统地研 究基因功能及其在生理和病理过程中的作用,遗传工程动物 模型是必不可少的研究工具。
• 显微注射法 • 胚胎干细胞法
(embryonic stem cells，ES细胞) • 逆转录病毒感染法 • 精子载体法 • 细胞核移植 • ENU诱变
第二节 转基因动物
1. 20世纪60年代末和70年代初，John Gurdon向蛙卵 和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能否在动物卵细胞和 早期胚胎中翻译。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和 空间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动 物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进 行敲除的技术。
表达水平不同
任何获得的首代小鼠的转基因可能不遵 照孟德尔遗传方式。如果整合发生在第 一个细胞分裂以后，首代小鼠的转基因 可能是嵌合的。嵌合可以导致在第一代 子代中遗传频率低于50%
如果卵子供者为近交 系（例如，C57），首 代小鼠应该与背景相 同的小鼠进行繁殖以 保持纯系的特性。对 于来自杂合的FVB/ C57 品种的首代小鼠，客 户必须决定是与一个 纯系进行回交还是维
2. 基本程序
✓打靶载体的构建 ✓打靶载体导入ES细胞：重组置换 ✓基因敲除ES细胞注射入胚泡 ✓胚泡植入假孕小鼠的子宫中 ✓嵌合体的杂交育种
Injection of ES cells into blastocysts
3. 优 点
✓外源基因整合情况的可控性高。 ✓可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、
表达的水平及插入的稳定性。 ✓外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛
选方便。
4. 缺 点
✓ES细胞系建立及培养困难 ✓维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 ✓所得个体为嵌合体
目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较 成熟，在大动物上应用较晚。
5. 在医学中的应用
✓遗传病研究 ✓肿瘤的研究 ✓生物制药
➢ 进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体 水平的表现调控规律。
➢ 转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性 研究。
➢ 也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。 ➢ 还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物
质。
第三节 基因定位突变动物模型
基因敲除
1 非条件型基因敲除 2 条件型基因敲除
• 按目的片断性质分
• ORF • 小分子RNA • cre
关键因素
• DNA concentration • Injection buffer • Visualizing pronuclei • Timing of injection • Size of DNA • Copy number ： 随机的 • Position Effect insulator
2XCSH4
双绝缘子HS4载体
转基因小鼠的外源基因是随机插入的小 鼠基因组上的，插入位置会对外源基因 的表达产生致命性的影响，我们构建的 CH4绝缘子可最大程度上减少插入位置 对基因的影响。
转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
拷贝数与转基因小鼠中基因表达的关系
YOU LIKE IT? CONTACT ME!
二 、 基本原理
➢目的基因：显微注射 受精卵或胚胎细胞 整合 植入输卵管
➢外源基因：顺式作用元件 结构基因 报告 基因(report gene) 融合基因
ZRS promoter
CDS
Poly A
转基因策略
• 按类型分：
• 全身表达： CAG, BACTIN, UBC,EIIa • 可诱导表达: TET ,ERT2 • 组织特异性表达
Ampicillin
CSH4 primer ES-1R3
BamHI (5291 )
pNCHS4 final empty
7885 bp
Rep(pMB1)
Kpn I (528 3)
AgeI (5243)
PUC-R
EcoRI (51 76)
I CEU-I
M luI (51 32)
CSH4 PRIMER
CSH4 PRIMER
一、 定 义
运用各种技术手段有目的地干预动物的遗传组 成，导致动物新的性状的出现，并使其能有效地遗 传下去，形成新的可供生命科学研究和其他目的所 用的动物模型，这类动物可被称为遗传工程动物模 型。
二 、 技术手段
➢ 显微注射转基因技术 ➢ 基因定位突变技术 ➢ 化学或放射诱变技术
三 、基本方法
绝缘子与外源基因在基因组整合示意图
我们设计的HS4载体（见前图），具有三大优点： 1. 二侧含I-CEU I,酶切位点，该序列用单酶切，因为具有28个识别碱基，90以上的基因均不含此酶切位点；2
该酶切位点产生的粘性未端四个碱基为非对称的，因此可以定向连接产生串连多拷贝，有文献报道在转 基因小鼠中可产生最多可产生36个拷贝。 3. HS4为本身为对向双绝子，在产生多拷贝串联时，每个表达区间具有四个绝缘子间隔，可将插入位点的影 响降至最低。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高 度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的 所有组织，并且在不同的培养条件下表现出 不同的功能状态。
源自文库
在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录
病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共 沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种 不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，