农杆菌介导油菜转化实验

农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程
一、所需试剂母液配制方法
1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。

2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。

6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。

7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

二、操作流程
1. 无菌受体材料的准备
选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度
2000 lx左右。

2. 受体材料的预处理
取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。

用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。

3. 供体菌株培养
1) 固体培养基和液体培养基的配制：此处给出常用LB培养基（Luria-Bertani）培养基的配制方法。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨（bacto-tryptone）10 g，酵母提取物
（bacto-yeast extract）5 g，NaCl 10 g，溶于800 ml去离子水中，用1 mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1 L。

高压蒸气灭菌20 min。

LB固体培养基：在LB液体培养基每升中加入细菌培养用琼脂粉（bacto-agar）12 g，高压蒸气灭菌后，待溶液冷却至60℃左右时，加入Kan（使终浓度为50 mg/L），旋转混匀（避免产生气泡），从烧瓶中倾出培养基至培养皿内，90 mm直径的培养皿约需20 ml培养基。

完全凝固后，应倒置平皿并贮存于4℃备用。

使用前1~2 h应取出贮存的平皿。

2) 单菌落农杆菌的培养：取出-70℃长期保存的菌种管，置于冰上，在无菌条件下，用接种针刮取冻结的培养物表面，迅速把黏附在接种针上的农杆菌划线于含50 mg/L Kan的LB琼脂平板表面。

菌种管重新置于-70℃保存。

将接种的琼脂平板在28℃下暗培养36~48 h。

3) 农杆菌扩增液体培养：用灭菌的牙签从琼脂平板上挑取生长良好的单菌落，接种到液体LB培养基（加入50 mg/L Kan）中，28℃振荡培养（200 r/min）过夜（16~18 h），使农杆菌培养至对数生长期，OD600值达0.4左右。

4) 以6000 r/min转速离心5 min收集菌体，用MS液体培养基洗2次，再用MS液体培养基（添加100 μmol/L AS，pH 5.4）重悬菌体，调OD600至0.4左右，轻微振荡培养2~3 h备用。

4. 浸染
于超净工作台上，将培养的根癌农杆菌液倒入无菌培养皿中（可根据材料对菌液敏感情况进行不同倍数的稀释）。

取出经过预培养的外植体，放入菌液中，浸泡4~5 min（不同材料处理时间不同），用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液。

5. 外植体与农杆菌的共培养
将浸染过的外植体接种到铺有一层无菌滤纸的共培养基（MS + 30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D + 100 μmol/L AS，pH
5.8）上，28℃暗培养2 d。

6. 脱菌（延迟）培养
将经过共培养的外植体用无菌水清洗数次，再用含500 mg/L Carb的MS 液于摇床上轻微振荡洗涤30 min，取出后用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干多余的水分，再将子叶柄朝下插入，下胚轴平放于脱菌培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 3~4 mg/L 6-BA + 0.05~0.1 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3 + 500 mg/L Carb , pH 5.8）上进行脱菌培养7~10 d。

7. 筛选分化及生根移栽
选取无污染的外植体转入筛选分化培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼
脂 + 3~4 mg/L 6-BA + 0.05~0.1 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3 + 10 mg/L Kan + 500 mg/L Carb, pH 5.8）上进行筛选培养，以后每15 d左右转接到相同的筛选分化培养基中，直到分化的不定芽长到2~3 cm时，自芽基部切下转入生根培养基（1/2MS + 30 g/L 蔗糖+ 0.9 % 琼脂+ 0.2 mg/L NAA + 500 mg/L Cef, pH 5.8）中诱导生根。

待根长出一周左右时，取出转化苗，无菌水洗净根部的培养基，移栽到灭菌的营养土（泥炭土：珍珠岩=3: 1)的纸杯中，在纸杯上罩上一个透明的塑料杯保湿1~2 d，移入室外再炼苗3~4 d，之后带土移栽入大田进行正常大田管理。

8. 转化植株目的基因的分子生物学鉴定检测外源基因在植物染色体上整合的主要方法有PCR、Southern杂交，但最可靠的方法是Southern杂交；检测外源基因在转录水平是否表达的主要方法有RT-PCR、Northern 杂交，但Northern杂交最可靠；检测外源基因在翻译水平是否表达的常用方法为Western杂交。

具体操作流程见小量法油菜叶片总DNA的提取、PCR、Southern杂交、Northern杂交及RT-PCR部分。

Western 杂交由于目前实验室尚无人涉及，暂不编写其操作方法。

9. 注意事项：
1) 由于不同基因型材料再生条件不同，为了获得较高的再生频率和转化频率，需要在品种之间进行选择，对于特定的材料则需要对激素浓度及配比进行调整，以建立受体材料的高效再生体系和转化体系；
2) 在进行转化之前，需要对受体材料进行选择剂敏感性试验。

根据不同的选择标记基因选用不同的选择剂，如新霉素磷转移酶II (nptII)基因使用Kan或G-148（Geneticin），潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因使用潮霉素B，PPT乙酰转移酶基因（pat，又称bar）则使用草丁膦（除草剂Basta 的活性成分）、草胺膦、双丙胺膦等；
3) 加入激素的方法是：在配制MS培养基过程中，加蒸馏水定容到所需体积时，先不调整氢离子浓度。

经过计算，将需加入的激素按一定量的浓度配比用吸管吸入；再滴入所需体积的MS培养基中，充分搅拌后再调整氢离子浓度，然后分装灭菌；
4) AgNO3、AS、Kan、Carb、Cef等物质不耐热，因此须在培养基冷却至60℃左右加入。