高效液相色谱相关技术

RP-HPLC中流动相组成与其性质的关系
离子抑制色谱（Ion Suppression Chromatography)
RCOO- + H+
RCOOH
R-NH2 + H+
+ R-NH3
流动相：缓冲液+有机溶剂
离子对色谱（Ion-pair(ed) Chromatography, IPC)
R-aq + C+aq [RC]aq [RC]org
高效液相色谱相关技术
报告人：王俊德
中科院大连化物所研究员
内容目录
一、液相色谱进展 二、液相色谱分离模式 三、柱技术和柱选择 四、HPLC样品制备与制备液相色谱技术 五、HPLC定性定量分析 六、液相色谱／质谱联用技术
一、 液相色谱进展
简单回顾 1970年代初，LC复苏，出现HPLC。 1990年代，HPLC仪器销售额年增长超过两位数，接近
有机：A 合成高分子
B 天然高分子（多糖凝胶） Sephadex, Argarose, 纤维素和淀粉，Chitosan C 多孔碳
几何结构
全孔，6~10nm，30nm以上
无孔微球，1~2µ m 表面多孔
分子烙印聚合物(MIP)
MIP 原理
共价键型
非共价键型
N-Cbz-L-Tyr
N-Cbz-L-Tyr
4）整体柱（Monolithic column） 单体、致孔剂、引发剂、添加剂一起在色谱柱内聚合 反应 灌注的原理 毛细管、一般分析柱、粗短柱（色谱饼）
5）膜亲和色谱（MAC）
生物专一性，选择性过滤 膜材料：尼龙膜，聚砜膜，纤维素膜 间隔臂：双环氧化物，已二胺，戊二醛 配基：氨基酸，肽，蛋白质，核酸或碱基，染料等 MAC将膜分离的低压、高通量与AC的高选择性和高分 离度结合在一起。

图4-2

图4-3

图4-4

图4-5
Ｂ．加速溶剂萃取(ASE) 图4-6


Ｃ．凝胶渗透色谱（GPC） Ｄ．超临界流体萃取(SFE)
2.制备液相色谱技术 2.1 目的 结构鉴定； 活性或毒理试验； 纯 物质的制备（如手性药物的制备等） 2.2 基本要点 Ａ．制备柱（半制备，制备级色谱柱）
有机/无机杂化修饰
POLYMER
O Si
OH Si
O Si
OH Si
O Si
O Si
碱性化合物的分离
流动相：V(甲醇)：V(水)=55：45 色谱峰：1 士的宁碱，2 普鲁卡因，3 罂素碱， 4 N,N-二乙基苯胺，5 氨茶碱
3 )限制孔通道结构
4 )高分子聚合物 ST/DVB， PA，PMA 亲水聚乙烯 (TSK gel PW )
对流孔（穿透孔）：600~800 nm
扩散孔： POROS POROS POROS R Q S 50~150 nm （反相 ） （强阴离子交换） （强阳离子交换）
Schematic diagram of perfusion chromatographic peaking particle 1 throughpore 2 diffusive pore
四．HPLC样品制备与制备液相色谱技术 1. 样品制备或样品前处理
1.1 目的 排除干扰； 浓缩富集（特别是对环境、农残和生 物样品）； 保持分析测试的仪器系统不受污染． 1.2 常用方法 粉碎;匀质；溶剂浸提；过滤离心；过柱吸附（经 典LC）；索氏提取；液－液萃取；膜滤；衍生化 等．
1.3 新发展的方法 Ａ．固相萃取（SPE）和固相微萃取（SPME） 图4-1
R=烷基，腈基，胺基，硝基，二醇基等 X1=-Cl, -OCH3, -OC2H5 X2=-Cl,-CH3, ,
正相色谱
固定相：如Lichrosphere-CN, -NH2,-DIOL,-NO2 流动相：同LSC
反相色谱
固定相：如Lichrosphere-RP18(即C18，ODS) -RP8(即C8) -RP2(即C2) -RP1 (即C1) -Phenyl(即苯基) 流动相：甲醇/水，乙腈/水，四氢呋喃/水， 二氧六环/水
S. P M. P.
C18, C8 MeOH/H2O (ACN/H2O)
[C+aq] =5~10mmol/L
离子对试剂的选择
反离子
季 胺 盐 类 （ 如 TMA ， TBA ， CTMA） 叔胺（如三辛胺） 烷基磺酸盐（如甲烷-，戊烷-，己 烷-，庚烷-，樟脑-磺酸盐） 高氯酸 烷基硫酸盐（如辛，癸，十二烷 基硫酸盐）
N-Cbz-L-Tyr
用分子烙印固定相分离手性对映体
1)基质材料 3，5，10• • • • • • µ m均匀SiO2 微球 I 硅酸钠------SiO2 凝胶 II 四乙氧基硅烷------Sol-gel技术------
超纯硅胶
2 )表面化学修饰
硅胶表面结构
残余硅醇基的影响
OH Si Si Si Si Si Si Si Si O H Hydrogen bonding N CO C2H5 O Si Hydrophobic interactions O- Ion exchange CH2 CH2 + N H
—SiO2吸附剂或基质 —有机化合物极性顺序： 氟代烷烷（烯）烃卤代烃醚酯酮、醛 腈醇酰胺胺酸 —异构体分离，组分离，flash chromatography
2. 化学键合相色谱（CBSP）
X2 Si O Si OH OH + X1 X2 Si X2 (CH2)n R O Si OH Si O Si X2 (CH2)n R
GC。 主要原因：生命科学、制药、现代农药和精细化工迅速 发展的带动以及HPLC自身分离条件的温和及高效、 高速高灵敏的特点。 新动向：特、微、大，特别是在蛋白质组学及手性分离 方面。
分离介质的新进展
1. 通用型HPLC固定相填料
化学组成
无机：A. SiO2 70%应用面，pH2~7.5 B. ZrO2 ， TiO2 ， Al2O3 耐碱性（~pH 11）， 但孔结构不如SiO2 理想 C . 羟基磷石灰（ Hydroxyapatite, HA) Ca10(PO4)6(OH)2, pH 5以上稳定（6.8）
使用中的去除内毒素装置
The affinity membrane filter which can be used for the selective removal of endotoxin frombiologicals, medicine preparations and some patient body fluids like ascites. The advantages of the membrane filter are high selectivity, high adsorption capacity, less nonspecific protein adsorption, less operation pressure and non toxic pollution. The membrane filter has been successfully applied to the removal of endotoxin from preparations of collagen, defibrase, some antibiotices, amino acids injection, human serum albumin injection since 1997. Usually, the percentage of endotoxin removed by the membrane filter is above 95% while the loss of the effective ingredient in preparations is less than 10%.
主要应用对象
阴离子表面活性剂，磺酸染料， 氢化考地松及其盐 磺酸盐，羧酸等 强/弱碱，苄烷基铵盐，儿茶酚胺， 肽，鸦片碱等 可与许多碱性物质生成离子对 与烷基磺酸盐相似，选择性有所 不同
3. 离子交换色谱（IEC，IC）
S.P.—ST/DVB,PA, 键合硅胶 M.P.—缓冲液（有时需加有机改性剂）
2. 生物大分子分离介质
1) 大孔填料 孔径比溶质分子直径大5倍以上 蛋白质MW 10万 100万 分子直径，nm 7.6（25.2） 16.3（81.6） 要求孔径，nm 38 82
2) 无孔填料
1~2 µ m，20 sec 5个蛋白质分离 容量小，柱压大，适用于分析分离
3) 灌注色谱 (Perfusion chromatography )
Ristocetin A
Avoparcin
II 柄状霉菌素类
III 多肽与氨基糖苷类
Thiostrepton
6）聚合物型
7）蛋白质类 (Protein) 牛血清白蛋白（BSA） 人血清白蛋白（HSA） -酸性糖蛋白（AGP） 卵粘蛋白（OV）
二 、液相色谱分离模式
1. 吸附色谱(AC, LSC)
6）逐步升压（流量）或逐步降压（流量）操作，尽量避 免突然大幅度升降压力（流量）。 7 ）柱压未降到0附近时，切勿打开放空阀或卸柱。 8 ）有机聚合物柱和特种柱，特别要注意生产厂家提供的 操作注意事项。 9 ）柱压生高怎麽办？找阻力源。筛板情况/更换。 10）关于柱子的反向冲洗。
11）关于正相/反相系统的更换。 12）柱子的维修。柱头污染物的清除及柱床下陷的填补。 13）样品的预处理。膜滤，Sep-Pak预处理小柱。 14）色谱纯溶剂的使用。 15）适用的流动相pH范围，柱子耐压范围。
A B B A
C C C
C D 手性面 D
C C C
C
A B
A B
手性轴
A D D C 手性碳
A
B
C
B
II 常用的手性固定相
1）Pirkle 型
2）环糊精型（CD）
3）配体交换型
4）多糖类（Polysaccharide）
5）大环抗生素类(Macrocyclic antibiotics) I 糖肽类
4. 体积排阻色谱（Size Exchusion Chromatography SEC)
凝胶渗透色谱（Gel Penetration Chromatograpy, GPC） 凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography,GFC）
5. 亲和色谱 （Affinity Chromatography, AFC ）
三、柱技术和柱选择
1. 色谱柱的选择 2 色谱柱技术 3 色谱柱的维护和保养
2) 柱装填
3 . 色谱柱的维护和保养
1) 保存在有机溶剂中，勿干固。 2）若干固，反相柱用甲醇，正相柱用己烷，0.2ml/min 缓慢润湿平衡后使用。 3）按流动方向接入仪器，不要敲击、振动。 4）对未知样品分析时，先进空白溶剂，再进样品，直 到获得重复的谱图。结束前，柱冲洗。 5）未知样品分析时，宜从溶剂强度大的流动相开始试 验（如甲醇、乙腈等），逐步降低溶剂强度，直到 获得满意分离。
亲和膜分离器
AFFINITY MEMBRANE FILTER
用于白蛋白、干扰素、碱性磷酸酯酶、溶菌酶、血纤溶酶原等生物 大分子的分离纯化及抗菌素、眼药水、氨基酸、白蛋白注射液、胶原 蛋白等多种医药制剂中内毒素的去除，去除率均高于95%，已在多家 医疗、化工单位推广应用。 微孔亲和膜装载于分离器中，操作压力由5-10MPa降到0.1-0.2MPa 采用特殊结构样品分配器，提高分离 效能 10-50倍 可根据样品量装载不同张数的亲和膜， 便于根据实际需要进行调节 F-,Cl-,NO3-,Ac-,SO42-等为例
泵
进样器
分离柱（低容量阴离子交换剂） NaOH
抑制柱（高容量阳离子交换剂/膜/器）
检测器（电导）
废液 在抑制柱内: (1) 流动相: Na+OH + R-SO3-H+ (2) 样品: K+Cl-, K+NO-3+R-SO3-H+ R-SO3-Na+ +H2O R-SO3-K+ +H+Cl-, H+NO-3
亲和膜分离器
OH O O P OO HO O O O O NH O HO O
O HO O O O O HO O NH O O O O P O P OH
14
14
14
12
14 14
大肠杆菌LPS类脂A的化学结构
圆圈中数字表示脂肪酸碳原子数目
3. 手性高效液相色谱固定相（CSP） I 手性 (Chirality)