荧光分析法检测原理及应用举例

1荧光定义

某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。

2荧光分类

由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。

3光致荧光机理

某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。

3.1 分子受激发过程

在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。

在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态，用S i表示，由此可推出，S0即为基态的单重态，S1为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i来表示，T1即为第一激发态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。

分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。图1表示激发态的分子释放能量的过程。

图1分子释放能量方式

3.2 分子的辐射跃迁过程

处于不稳定激发态的分子会跃迁至能量较低的能级，释放能量，如图2为激发和发射能级跃迁图。辐射跃迁的过程会发出荧光或磷光。

荧光过程（F）：当分子在激发态跃迁至此激发态的最低振动能级后，仍不稳定，继续跃迁至第一激发态的最低振动能级，并伴随着振动弛豫和能转换的发生。到达第一激发态的最低振动能级，进而再跃迁至基态，并伴随着能量辐射，此辐射光即为荧光。图2中F表示荧光辐射。由于分子在较高的能级跃迁至第一激发态的最低振动能级时，消耗能量，因此，分子跃迁至基态发出荧光，能量小于激发态的能量。荧光的发射波长大于荧光激发光的波长。

磷光过程（P）：如果分子在较高激发态释放能量跃迁至第一激发态的最低振动能级，并没有继续跃迁至基态的不同振动能级，而是系间跨越至此激发态的一个三重态，从三重态跃迁至基态的各个不同振动能级，发出磷光，如图2中的P 过程。由于系间跨越消耗一定的能量，因此磷光发出的能量要小于荧光发出的能量，磷光具有比荧光长的发射光谱。

3.3 分子的非辐射跃迁过程

处于不同激发态的分子，并不是所有的都进行辐射跃迁，有些过程属于非辐射跃迁，如：系间跨越、各个激发态之间的内转换与外转换、激发态内部的振动弛豫。

系间跨越（ISC）：表示分子在激发态的单重态跃迁至此激发态相同能级的三重态，发生的原因为电子的自旋角动量之和不等于0，系间跨越导致发射的荧光强度非常微弱。并不是所有的分子都会发生系间跨越，一些物质分子中含有质量较重的原子，或分子中含有顺磁性物质（如氧分子），容易发生系间跨越。图2中ISC为系间跨越过程。

内转换（IC）：表示分子从某一激发态的最低振动能级跃迁至下一个激发态的最高振动能级，并释放能量的过程。由于跃迁前后的两个能级能量差别较小，因此内转换过程释放的能量较少，图2中IC为内转换过程。

外转换：表示溶液中的溶质分子在运动过程中与其他物质碰撞，碰撞过程使得溶质分子具有的能量降低，外转换出现于溶质分子由第一激发态的最低振动能级向基态的最高振动能级跃迁的过程，导致发射的荧光或磷光强度衰减或猝灭。

振动弛豫（VR ）：表示处于激发态的溶质分子，在运动过程中与其他介质的分子相互碰撞，将能量传递给介质分子，并跃迁至相同激发态的最低振动能级。图2中VR 为振动弛豫过程。 S2

S1

S0V

A2A1F IC IC

IC IC ISC

ISC

P S0

T1

T2VR

VR

VR

VR

VR

图2 分子能级跃迁示意图 4 影响荧光强度的因素

4.1 分子内部因素对荧光强度的影响

有机物的种类繁多，并不是所有的有机物都具有光致荧光效应。具有发射荧光特性的有机物，其分子结构比较特殊，在紫外-可见光范围内能够对激发光有吸收作用，而且物质分子具有发射荧光的量子效率，即量子产率。

4.1.1 量子产率

荧光物质的量子产率表示其发射荧光的能力，分子的量子产率越高，发射荧光的能力就越强。量子产率的定义为：在激发光作用下，物质发射荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比ΦF ：

A

F F N N =Φ（1） 式中ΦF ——量子产率；

N F ——发射的荧光光子数；

N A ——吸收的激发光光子数。

分子在激发光的照射下，吸收光能量，跃迁至激发态，并回到基态发出荧光，分子回到基态的过程分为辐射跃迁和非辐射跃迁返回两种形式。用辐射跃迁和非辐射跃迁的分子数来表示荧光量子产率，可以表示为：

∑Φ+=K

k k F F F （2） 由式2可知，荧光的量子产率与分子的非辐射过程和辐射过程有关。当辐射过程的荧光常数越大时，荧光量子产率越大；当非辐射过程的跃迁速率越大时，荧光量子产率越小。有光致荧光的原理可知，荧光量子产率总是小于1，物质的荧光量子产率越大，说明有更多的分子参与辐射跃迁，发出的荧光强度就越强。