蛋白质工程

FDA 批准的生物制品
时 期
1982-1989
批准的数目 临床试验期 审评期
总时间
14
32.7
24.0
53.2
1990-1994
1995-1999
15
26
46.5
58.6
21.3
14.7
67.8
73.3
* 时间单位为月
生物工程制药研究的几个热点领域
EGF

抗体药物研究 组合生物合成技术研究 血管抑制剂抗肿瘤药物研究 功能基因组学研究
1.5 20-100 志愿者
安全性 和剂量
2 100-500 病人
有效性和 副作用 1/5
3.5 1000-5000 病人
15
FDA
递 安全性、生物 交 活性和制剂 IND 1/5000
FDA
递 有效性和 交 副作用 NDA
1
R & D of a New Drug—an Example
Endostatin – an angiogenesis inhibitor
Hold an Ethical Meeting before
Initiating Clinical Trials: Is It
Ethical for the Protocols to be Practiced in Clinical Trials?
Apply for New Drug Certificate
生物工程（技术）的概念
生物工程（技术）— 采用细胞及分子的方法解决问 题或制造产品 Biotechnology — The use of cellular and molecular processes to solve problems or make products.
生物工程（技术）的范围
Document Preparations
Apply for Pilot-Production
SFDA Holds Consulting Meeting (1st)
Make up Suggested Tests (if any)
Re-submit Application to SFDA
SFDA Holds Consulting Meeting (2nd) (optional)
生物工程前沿
蛋白质工程
罗永章
蛋白质化学实验室 清华大学生物科学与生物技术系
课程时间变更通知
按照学校国庆节假期规定： 9 月 27 日（周六）将补上 10 月 6 日的课 请注意 “十一” 前课程安排如下：
9 月 27 日 7:20 — 9:45 PM， 罗永章
9 月 29 日 7:20 — 9:45 PM， 刘进元
Endostatin 的结构与抑瘤效果
•
Endostatin 是ⅩⅧ型胶 原C-末端的184个氨基酸 片段, 具有抑制血管生成 的作用。
•
重组鼠 Endostatin 可 以完全抑制小鼠肿瘤细胞
的生长,并且不产生耐药
性,经过几轮给药后小鼠 的肿瘤被治愈。
Endostatin 抑制肿瘤生长且不产生耐药性
• 因无法有效的解决复
性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元
包含体电镜图
量无活性包含体。
蛋白药物制剂稳定性与蛋白质结构的研究


BSA 在不同湿 度下的溶解度
胰岛素在不同湿 度下的溶解度
冻干过程中蛋白质 二级结构的变化
Confirmation of Refolded Proteins
血管内皮抑制素（Endostatin）的发现

O’Reilly et al, Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88，277～285, 1997

Boehm et al, Antiangiogenic therapy of experimental cancer dose not induce acquired drug resistance. Nature 390，404～407, 1997
1982 年 FDA 批准了第一个基因工程药物--重组人胰岛素
1983 年 Mullis 发明了聚合酶链式反应 (PCR) 技术
1990 年人类基因组(Human Genome Project)计划启动
1997 年克隆羊多利诞生
2000 年人类基因组序列草图完成
世界上第一个生物技术公司
1976年4月7日 Herb Boyer 和 Bob Swanson 创建了 Genentech 公司，标志着生 物技术产业的诞生。
功能基因组（Functional Genomics）研究与药物研发
人类功能基因组学研究在全球范围内迅速展开…
1. 2. 3. 4. 5.
投资巨大 耗时持久 竞争激烈 人员众多 影响多种行业: 制药业, 生物技术业, 农业, 保健业, 食品业, 电子与信息业…...
功能基因与药物研发
私人资本大量投入 小的生物技术公司 有迅速成长的机会
近半个世纪生物技术发展的10大里程碑
1953 年 Watson 与 Crick 发现了 DNA 的双螺旋结构
1956 年 Kornberg 发现了 DNA 聚合酶
1966 年破译了氨基酸三联密码子
1970 年发现了核酸限制性内切酶 1975 年研制出了第一个单克隆抗体
近半个世纪生物技术发展的10大里程碑
Flow Chart of R & D of a New Drug
Lab Scale: Function Validation GMP Production Quality Control Pre-clinical Trials Clinical Trials SFDA Initial Approval Drug Initial Sales SFDA Final Approval
Pre-clinical Trials (animal tests)
Efficacy Tests
Toxicity Tests Pharmacokinetics
Apply for Clinical Trials Approval
Documents Preparations Apply for Clinical Trials to SFDA SFDA Holds Consulting Meeting (1st) Make up Suggested Tests (if any) Re-submit Application to SFDA SFDA Holds Consulting Meeting (2nd) (optional) SFDA Issues Clinical Trials Approval
SFDA Issues Approval of Pilot-Production SFDA Issues New Drug Certificate
美国新药研究的过程
临床研究 发现 / 临床前研究 年 研究 内容 目的 成功率 6.5 实验室和 动物研究 向 Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅲ期 FDA 向 1.5 评价 是否 批准
Amgen 以1.4 亿美元购
买肥胖（Obesity）基 因
Gleevec、Herceptin
等源于基因功能研究 的药物上市
诺华投资2.5亿美元建 立功能基因组研究院 MS、IBM、Motorola
蛋白质复性技术与药物研发
蛋白质复性概念
将蛋白质从结构不规则、无 活性的状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性的 状态的过程称为蛋白质复性。
Regress Tumor with Endostatin (From O’Reilly)
Endostatin does not induce drug resisitance (From Boehm)
Endostatin 对荷瘤鼠的抑瘤作用
Endostatin 研发的难点之一 — 复性问题
超过 99% 的 Endostatin 不能复性
HPLC Analysis: SDS PAGE: Reduced & Oxidized Peptide Map Protein Compactness Reduced & Oxidized
Mass Spectrometry:
Fluorescence Emission: iso-electrophoresis: pI
单克隆抗体技术 细胞培养技术 分子克隆 克隆技术 细胞克隆 动物克隆 重组DNA技术 蛋白质工程技术 生物传感器 组织工程技术 杂交技术 生物芯片技术 生物信息学技术
生物技术与医药
药品 疫苗 诊断试剂
基因治疗
干细胞研究
基因组学与蛋白质组学
结构基因组学与功能基因组学
美国生物制药现状

目前 FDA 已经批准了 117 个生物技术药物和疫苗，其中 75% 为最近 6 年批准

有 350 生物技术药物和疫苗针对超过 200 种疾病正在进行临
床试验 有几百种诊断试剂应用于疾病诊断、血液检定等 美国目前有 1273 家生物技术公司，其中 300 家是上市公司 1999 年至 2000 年生物技术市场资产总值增长156%，从1379

亿美元增加至 3535 亿美元

1993 年至 2000 年生物技术工业收入成倍增长，从 80 亿美元 增加至 223 亿美元
NMR Spectra: Unfolded vs Refolded ELISA: Unfolded vs Refolded
Activity Assay: Unfolded vs Refolded
血管抑制剂抗肿瘤理论的建立


Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N. Engl. J. Med., 285, 1182-1186, 1971 Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg., 175, 409-416, 1972
采用大肠杆菌作为宿主细胞的特点

效率高、产量大 周期短、成本低 工艺稳定、质量可控

缺点是易形成包含体
大肠杆菌与真核细胞表达系统比较
大肠杆菌:
发酵 包含体 复性 纯化 目的蛋白
真核ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞:
发酵 上清液 纯化 目的蛋白
大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体
• 高效表达的目的蛋白
在大肠杆菌内形成大