从环境中分离产淀粉酶的菌株

从环境中分离产淀粉酶的菌株

一．【实验目的】

1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点 并分析不同条件下酶的特性。

4. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。

二．【实验原理】

淀粉酶广泛在于动植物和微生物中是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

三．【仪器和材料】

（一）仪器

1、恒温培养箱

2、高压蒸气灭锅

（二）材料

培养基配制：

1.培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%；

2.富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、pH7.0；

3.分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、Na2HPO40.2%、pH7.0。

四．【实验方法】

1.采样与稀释：

从实验楼前的小树林中采集土样，称取5g土样，放入装有45mL无菌水的三角瓶

中, 震荡20m in后静置5min。然后对其进行浓度梯度稀释到10-6, 分别稀释到

10-4、10-5、10-6浓度下。

2.富集培养：

从上述土壤稀释液中各取 1 mL注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷却至

50℃左右的富集培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37℃保温箱中培养24小时。

3.初步筛选：

培养24小时后，取出平板，向平板中注入1滴革兰氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，

如菌落周围有无色透明圈，说明该菌能分解淀粉，即该菌株可以产生淀粉酶。通过

影印法或点种法将可以产生淀粉酶的菌株接种到相同的无菌培养中，重复操作进行

培养。

4.分离纯化：

初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将划线分离后的培养皿放入37 ℃培养箱中培养24小时。

5.性能测定：

①标准曲线的制作：

取7支20ml预先洁净灭菌干燥的试管，编号，加入试剂见表1。每个浓度做3

个平行样本。摇匀，至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容

至20ml，以1号管作为空白调零点，在520nm的波长下比色测定吸光度值，

并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

②酶活力测定：

i.首先制备待测粗酶液：取培养好菌株的分离培养基进行4000rpm离心

20min，并收集上清液即为待测粗酶液。

ii.取20ml预先洁净灭菌干燥的具塞刻度试管，编号。并按步骤操作：取粗酶液1.0ml →加2%的可溶性淀粉1ml，蒸馏水3ml，于60 ℃水浴中

预热5min →加0.1ml/l柠檬酸缓冲液（pH6.0）1ml于60 ℃水浴中

保温30min →加3，5-二硝基水杨酸1.5ml，沸水浴中煮沸5min，迅

速冷却，加蒸馏水定容至20ml。

iii.空白对照：取粗酶液1.0ml，加入pH1.0的盐酸钝化淀粉酶，使酶失活，在按照以上步骤操作。定容、摇匀后，用分光光度计测定520nm处的OD

值。

iv.在上述条件下，以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

五．【实验结果】