亲和层析技术

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亲和层析技术以其高选择性和可逆性开创了生化分离的新纪元， 亲和层析技术具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等 优点，广泛的应用于生物大分子的分离纯化。特别是对含量极少的 基因工程产品的一步纯化，更显示出这一技术的优越性．随着临床 对药用蛋白等生物工程产品需求的不断加大，这对生物下游的分离 技术的发展，尤其是亲和层析技术的发展将具有非常大的推动。 亲和层析也有一些缺点，主要是载体(如琼脂糖)价格昂贵，机械强 度低；配基制备困难，有的配基本身需要分离纯化；配基与载体偶 联条件激烈等。要解决这个问题，关键是找到合适的配体。这些配 体要有价格合适、机械强度高、制备容易、容易偶连等特点。组合 化学、基因工程等科学技术的高速发展，将大大推进亲和层析技术 向前发展。 亲和层析技术和其他分离技术的结合，虽刚发展，但将在生化分 离中得到广泛和层析载体种类有限，且价格昂贵，远不能 满足科研工作的需要。在实际应用中，往往需要对载体 进行修饰改性或自制新的载体，使其更有利于亲和吸附 的进行，以满足大规模工业生产的需要。据文献报道在 我国壳聚糖 (Chitosan) 被广泛用于亲和层析载体。其特 点是：没有非特异性吸附作用；配基偶联方法简单。此 外，Dommimic C. N.等以聚苯乙烯-二乙烯基苯 (PSDVB) 珠为载体，用聚乙二醇 (PVB) 修饰其表面，制 成了新的亲和层析载体。这种载体具有良好的机械强度， 且 PVA 涂层消除了疏水相互作用，避免了非特异性吸 附的发生。因此，研制价格低廉、机械强度高、活化效 率高的新型载体是亲和层析的一大热点。
2 载体的选择 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制 备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因 此，亲和吸附介质又称亲和载体。 作为载体的固体粒子应满足下列要求：(1)具有亲水性多 孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；(2)物理和化学 稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；(3)含有可 活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；(4)粒径均一 的球形粒子。 常用的亲和层析载体有：琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、 聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝 胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有： 聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。
张慧 7012108013 生物工程091班
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利 用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸 附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层 析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离 和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、 激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等; 也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。
1． 配基的选择 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体 相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联 的一方就叫作配基。 在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据 分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争 性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制 剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质， 选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白， 选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白 质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、 DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基。
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或 形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。 目 的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨 酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基， 十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这是 IMAC用于蛋白质分离纯化的根据。金属离子如 锌和铜 ，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合，含有不同数量的这些基团 的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。
生物亲和层析（BAFC） 免疫亲和层析（IAFC） 金属离子亲和层析（IMAC） 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC）
生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异 性相互作用物质对的亲和层析。 通常具有高的选择性。典型的物质对有酶- 底物、 酶-抑制剂、激素-受体等。 -
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离 系统，称免疫亲和层析。免疫亲和层析应用相当广泛。 许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克 隆抗体作为亲和配体。目前，利用抗体 -抗原模式，有可 能得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基，通 过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质 。此种方法的纯化 倍数活性回收率非常高。蛋白 A和蛋白G作为抗体结合 蛋白已被应用于免疫亲和层析技术，是分析人类免疫球 蛋白，特别是 IgG-类抗体的很好的免疫亲和层析的配体。 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测 法,特别适用于检测含量低微的样品。免疫检测法利用被 标记的抗体或模拟分析物来进行间接的被分析物的分析。 常用标记如酶标记、荧光标记、化学荧光等。
拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用， 模拟生物分子结构或某特定部位。以人工合成的 配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析，如以 染料亲和层析和氨基酸(包括多肽亲和层析)染料 ( ) 配基,例如三嗪或三苯甲烷化合物,能通过共价键 牢固地结合到亲和载体上,染料配体与很多蛋白 以及酶的活性位点相互作用，以模仿这些生物分 子的底物、辅助因子或结合剂的形式进行。
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亲和层析属于吸附层析。其原理是依据生物高分子化合 物所特有的生物活性的不同来进行分离提纯。即利用生 物高分子物质可以和其相应的配体进行专一结合和可逆 解离的特点，将配体或某生物高分子物质偶联到固相载 体上成为不溶性网状结构，再经层析法吸附液相中相对 应的成分，通过吸附与解吸附来达到从其它杂质中分离 某种生物高分子物质或相应配体的一种新的分离方法。 如某种抗原能和它的配体——相应的特异抗体进行专一 结合，某种酶和它的配体——底物或抑制剂专一结合， 形成抗原-抗体复合物或酶-底物(抑制剂)复合物，用适当 方式将复合物从混杂物中分离出，然后用一定的试剂把 复合物重新拆开，从而获得纯净的抗原、抗体和酶等， 达到纯化和浓缩的目的。其原理模式图见下页
亲和层析技术的最大优点在于.利用它可以从粗 提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯 度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单 克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血 液凝固因子、分离纯化药物蛋白等 生物大分子最重要的方法之一。
近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于 那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方 法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术 就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯 化的效率上可以说是最重要的方法之一。
3 .基质活化和偶联 大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活 化基质通常经过与抗体表面残基的—NH反应将抗体偶 联，偶联反应也可通过与抗体表面的一0H、一C00H或 一NH进行。 在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间， 以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响。 当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会 阻碍抗体与抗原的相互作用。 最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多 糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳 定的基质已商品化，在仅仅需要少量基质时可以购买。 如果基质的需要量大，自己进行活化更为经济。
与其它生化分离方法相比，亲和层析技术具有高收率、高纯度、能 保持生物大分子天然状态等优点，广泛的应用于生物大分子的分离 纯化，特别是对含量极少的基因工程产品的一步纯化，更显示出这 一技术的优越性。正是因为亲和层析技术的高度特异性 ，才能制备 出高纯度的生物大分子，不仅用于大规模生产而且用于动力学研究 和结构测定 (亲和标记、核磁共振、X-射线衍射等) 此外，亲和层析 与分子生物学相结合，是一种很好的技术手段。如Mason 等利用该 方法发现两个大肠杆菌抗转录终止因子即NusB和核糖体蛋白S10能 相互作用。将S10偶联到Affi-Gel载体上，大肠杆菌粗提物通过层析 柱，用不同的条件洗脱，收集洗脱蛋白，进行SDS-PAGE分析。用 抗NusB抗体进行Western blotting进一步证实，NusB能与S10相互 作用。 但是亲和层析技术也有一些缺点，主要是载体 (如琼脂糖 Sepharose) ，价格昂贵，机械强度低 (易压床)；配基的制备困难， 偶联条件激烈，需要使用剧毒的活化剂 (如CNBr)等。为了更好的克 服这些缺点，便形成了亲和层析技术发展的两大趋势 ：
亲和层析是利用生物活性物质之间的特异亲和力 ,使目 标产物得以分离纯化的液相层析法 .亲和层析可应用于任 何两种有特异性相互作用的生物大分子,如酶与底物 (包 括酶的竞争性抑制剂和辅助因子)、抗原与抗体、 激素与 受体、 核酸中的互补链 、多糖与蛋白复合体等 。正是 因为利用的是生物学特异性而不是依赖于物理化学性质， 因而非常适合于分离低浓度的生物产品。当预分离的料 液通过层析柱时 ，样品中对配基有亲和力的物质便借助 静电用 、疏水作用 、金属配位作用、 氢键作用和弱共 价键作用 ‘以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上 。 根据配基与生物大分子作用体系不同 ，可以把亲和层 析分为以下四性结合的多肽配 基。 这一观点的提出大大促进了方法，从成千上万 的多肽中筛选出用于目的蛋白分离的法的巨大优点来看，它将是亲和层 析研究的另一热点。
4 洗脱问题 洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法，通过 改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定 化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲 和吸附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不 强，当连续通过大体积的平衡缓冲液时，便可在紧随杂蛋白洗出蜂 后，得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子，必 须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法，利用含 有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱 剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。另 一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这 一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂 硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离， 再分出欲纯化的生物大分子。