一种优化的质粒转化简便方法

转化效率／转化子数瞄。（１０５）
冰浴时间（ｍｉｎ）
菌株 转化质粒 ２
５
ｌＯ １５ ２０ ２５ ３０
４０
ＤＨ５ａ ＤＨ５ｃｔ
ｐＵＣｌ９ ｐＢｌｌ２１
４．０ ５．１ ５．０５ ５．０ ５．１ ５．３ ５．２ ３．２ ５．０ ５．０ ５．１ ５．１ ５．２ ５．３
５．３ ５．２
ＪＭｌ０９ ＪＭｌ０９
ｐＵＣｌ９ ｐＢｌｌ２１
质粒ＤＮＡ和感受态细胞混匀后，冰浴时间对转化效率也 有影响，本实验检测了ｐＵＣｌ９和ｐＢｌｌ２１两种质粒分别转化 ＪＭｌ０９和ＤＨ５０ｔ时，在不同的冰浴时间对转化效率的影响，如 表ｌ所示，冰浴５ｍｉｎ足够满足一般实验的需要，不会对转化的 效率产生太大的影响。 表１ 热休克前冰浴时间对转化效率的影响
Ｔａｂｌｅ Ｉ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｃｅ—ｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
参考文献：
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转化效率／转化子数峭“（１０５）
热休克后冰浴时间（ｍｉｎ）
菌株 转化质粒 １
２
３
４
５
６
７
８
ＤＨ５ａ
ｐＵＣｌ９
４ ５．１ ５．１ ５．２ ５．１ ５．１ ５．１ ５．２
ＤＨＳａ
ｐＢｉｌ２１
４ ５．１ ５．２ ５．１ ５．１ ５．０ ５．１ ５．１
ＪＭｌ０９
ｐＵＣｌ９
４ ５．１ ５．２ ５．１ ５．１ ５．０ ５．１ ５．１
２０１１年２１（１）
生物技术
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图３ 加入Ｊ００ｔｄ．除檐剂柠檬酸钠所提取的ＲＮＡ的电泳图 Ｆｉｇ．３ ＲＮＡ Ｇｅｌ ｏｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｅ ｗｉｔｈ １００１－ＬＬ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ
图４加入３００ＩＪｄ．除糖剂柠檬酸钠所提取的ＲＮＡ的电泳图
Ｆｉｇ．４ ＲＮＡ Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｅ ｗｉｔｈ ３００“１．．＇ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ
—１１６．
［１４］Ｓｍｉｔｈ Ｎ Ｒ．Ａ ｒａｐｉｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ［Ｊ］．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，１８（３）：１６—２０． ［１５］Ｌａｎｇｅｂｅｌｄ Ｎ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊ ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒ０１．。１９９５。４０（２）：５７—６６．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｌａｓｍｉｄ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ
万方数据
生物技术
２０１１年２１（１）
质粒转化是分子克隆中常用的技术之一，１９７２年Ｃｏｈｅｎ 用ＣａＣｌ：法成功地将Ｒ因子和重组质粒ＤＮＡ导人大肠杆菌细 胞…。此后，ＣａＣＩ，法作为一项经典分子生物学转化技术沿 用至今，其间虽有小的改进，但都旨在提高制备感受态细胞 转化效率，影响转化效率的因素上汪。１。对转化过程的优化也 有报道∞“Ｊ。常规转化过程一般需要２ ｈ左右。本文对质粒 转化大肠杆菌感受态细胞的冰浴时间、热休克时间、预培养时 间等条件进行了较系统的研究，提出了快速、简便的质粒转化 方法。 ｌ材料和方法 １．１材料 １．１．１实验材料
３．８ ５．２ ５．１ ５．１ ５．１ ５．１ ５．３ ３．９ ５．１ ５．０ ５．２ ５．１ ５．３ ５．２
５．３ ５．１
２．２热休克时间对转化效率的影响
为了检验４２。Ｃ热休克时间对转化频率的影响，用ｐＵＣｌ９
收稿日期：２０１０—０６—２９：修回日期：２０１０—１０一２２ 作者简介：壬友如（１９７２一），男，博士，讲师．研究方向：生物化学与分 子生物学，Ｅｍａｉｌ：ｗｙｒｌ９７２９１８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
２、３、４、５、６、７、８ ｒａｉｎ；
（４）每管加３７。Ｃ预热的５００斗１ ＬＢ液体培养基，于３７℃水 浴２ｍｉｎ后，３７℃预表达培养时间分别设置为５、８、１３、１７、２３、
２８、３８ｍｉｎ。
（５）取１００｝ｍ上述培养物分别转移到含抗生素的３７℃预 热的ＬＢ固体培养基上，无菌涂布器均匀涂布菌液。
（６）涂布后的平板置于３７℃，约２ ｈ后液体被吸收，再倒 置平板，于３７℃培养１２～１６ｈ后计数单菌落，转化效率计算参 考一Ｊ。以上每次实验重复３次。 ２结果与分析 ２．１ 热休克前冰浴时间对转化效率的影响
ＪＭｌ０９
ｐＢｌｌ２１
４ ５．１ ５．１ ５．２ ５．１ ５．０ ５．１ ５．２
２．４预培养时间对转化效率的影响 传统的转化方法中要求热休克、冰浴后加入ＬＢ培养基预
一种优化的质粒转化简便方法
王友如
（湖北师范学院生命科学学院基因工程实验室，湖北黄石４３５００２）
摘要：目的：质粒ＤＮＡ转化时，比较不同的冰浴时间、热休克时间、预培养时间对转化效率的影响。优化质粒ＤＮＡ转化方 法，缩短了转化时间，该方法可获得与常规转化方法相当的转化效率。方法：质粒ＤＮＡ加入感受态细胞中，混匀冰浴５ｍｉｎ，４２℃ 热休克６０ｓ，接着冰浴Ｉｒａｉｎ，３７℃预培养１０ｒａｉｎ，涂布预热至３７℃的平板。结果：操作时间由２ｈ减至２０ｍｉｎ，转化效率没受影响。 结论：该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。
Baidu Nhomakorabea
关键词：质粒；转化；优化；感受态细胞
中图分类号：Ｑ７８１
文献标识码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—３１１Ｘ．２０１１．０１．０１７
Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ
ＷＡＮＧ Ｙｏｕ一１＂１１
质粒ＰＵＣｌ９、ｐＢｌｌ２１，大肠杆菌ＤＨ５ａ、ＪＭｌ０９作者实验室 保存。 １．１．２试剂
ＬＢ培养基、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ、ＳｏｌｕｔｉｏｎⅢ、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ等 均按《分子克隆实验指南》第２版的要求配制。 １．２ 方法
１．２．１感受态细胞的制备 按照《分子克隆实验指南》第２版所提供的ＣａＣＩ：制备感
受态方法。 １．２．２质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌
（１）将５０ ｎｇ的质粒与１００１ｘｌ感受态细胞混匀，冰浴时间 分别设置２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０ ｒａｉｎ。
（２）离心管放到４２℃循环水浴中分别热激１５ｓ、３０ｓ、４５ｓ、
６０ｓ、７５ｓ？９０ｓ、１０５ｓ，１２０ｓ。
（３）快速将离心管冰浴，使细胞冷却，时间分别设置为１、
［８］张玉进，孟祥春．非洲菊花瓣总ＲＮＡ提取方法的改进［Ｊ］．植物学 通报，２００１，１８（６）：７２２—７２６．
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转化效率／转化子数峭“（１０５）
菌株 转化质粒 １５ ３０ ４５
１０５ １２０
ＤＨ５ｄ ＤＨ５氆 ＪＭｌ０９ ＪＭｌ０９
ｐＵＣｌ９ ｐＢｌｌ２１ ｐＵＣｌ９ ｐＢｌｌ２１
Ｏ．１ ２．１ ３．４
２．１ Ｏ．０３
Ｏ．２ １．８ ３．２
２．１ Ｏ．０２
黼∞一＂”¨：； Ｏ．１ ２．１ ３．２
０．２ １．７ ３．１
２．２ Ｏ．０３
ｏ旦”：：＂¨ 时７一生￡量ｉ问５一，●●●
２．３ Ｏ．０２
２．３热休克后冰浴时间对转化效率的影响 热休克后冰浴时间对转化效率的影响见表３。此步骤冰
浴时间２ｍｉｎ比较合适，对转化效率没有太大影响。 表３热休克后冰浴时间对转化效率的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｃｅ—ｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
和ｐＢＩｌ２１两种质粒分别转化ＪＭｌ０９和ＤＨ５ａ。结果（表２）表 明４２℃热休克最适时间为６０ｓ，处理时间延长转化率降低，这 可能是细胞死亡较多所致。 裹２热休克时间对转化效率的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｔ—ｓｈｏｃｋ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
从图２～４的ＲＮＡ电泳图中就可清楚地看到，在实验过程 中除糖剂是否添加以及添加除糖剂的量对所提取ＲＮＡ样品 的质苣有很大的影响，因此，除糖剂的添加以及添加量是本实 验材料ＲＮＡ提取的一个主要影响因素。 ３讨论
综上所述，在甜菜单体附加系Ｍ１４的叶和花等组织的总
ＲＮＡ提取时，加入１／３倍体积左右的柠檬酸钠等除糖剂，能够 有效的去除多糖的干扰，大大提高所提ＲＮＡ的质醴。从而为 接下来进行的Ｎｏｒｔｈｈｅｍ杂交分析，纯化，ｍＲＮＡ以用于体外翻 译或建立ｃＤＮＡ文库，ＲＴ—ＰＣＲ及差示分析等研究打下了坚 实的基础。
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ ４３５００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｅ ｃｏｌｉ ＤＩ－ＩＳｏｔ ａｎｄ ＪＭｌ０９ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ａ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ＣａＣｌ，ｗａｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄ：５—１０ｍｉｎ ｉｎｅｕｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｏｎ ｉｃｅ， ｈｅａｔｅｄ—ｓｈｏｃｋ ａｔ ４２℃ｆｏｒ ６０ｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ２ｍｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｏｎ ｉｃｅ。ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ａｔ ３７℃ｆｏｒ ２ｍｉｎ ａｎｄ ８ ｒａｉｎ ｏｆ ｓｈａｋｉｎｇ ａｔ ３７℃．Ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｎｔｏ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ ｐｒｅｗａｒｍｅｄ ｔｏ ３７℃．ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １０５ ｅｏｌｏｎｉｅｓ／ｉ＊ｇ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｒｅｓｕｌｔ： Ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ Ｗａｓ ｓｈｏｒｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ２ ｈｏｕｒｓ ｔｏ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅｒ ａｎｄ ｌｅｓｓ ｔｉｍｅ—ｗａｓｔｅｄ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒ－ ｍａｌ ｏｎｅ．