植物组织培养与器官培养

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3.1.4.3 微生物污染问题
• 原因
– 消毒不彻底
• 外植体消毒问题 • 培养基及器皿消毒问题 • 环境消毒问题
– 无菌操作不过关
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外植体消毒问题
• 外植体取材 外植体(expant)是指用于离体培养的活的 植物组织。 来源：
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外植体消毒问题

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器皿消毒灭菌
• 手术刀 • 镊子 • 平皿
• 干热灭菌 150-160℃，2h
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无菌操作设备
环境消毒问题
防止空气对流
定期消毒
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无菌操作问题 评价下列操作正确与否
•
外植体灭菌的过程：
流水冲洗10~20min
表面消毒
无菌水冲洗4~5次
沥水待用
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Flash
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常用消毒剂消毒灭菌效果比较
消毒剂 使用浓度% 去除的难易 消毒时间min 效果
9~10 次氯酸钙 2 次氯酸钠 漂白粉 饱和溶液 1~2 溴水 10~12 过氧化氢 0.1~1 升汞 70~75 酒精 抗生素 4~5(mg/L) 硝酸银2013-5-28 1
• 培养基配制过程
–药品 –器皿
按顺序混合 水洗 干燥 冷却
pH调整 加热溶解 分装培养基 加塞 高压蒸汽灭菌
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3.1.3.5 常用培养基
• 到目前研制开发了数十种适宜不同植物、 不同组织、不同细胞生长发育的培养基 配方。但多数培养基配方是在几种普遍 应用的培养基上演变而来的。 • 这几种常见的培养基为是：MS、ER、 B5、N6、NT、White等，其配方如下：
–IAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压 易受破坏； –2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动 脱分化阶段； –诱导分化则用NAA、NBA或IAA。IBA诱导生根效 2013-5-28 22 果最好。
（二）细胞分裂素类
6-BA
促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化 不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、 抑制离体组织或器官衰老。
• 乙烯
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3.1.3.4 植物细胞工程培养基配制
• 培养基母液的配制 – 大量元素一般配成10倍浓度的母液； – 微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液； – 混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以 免沉淀； – 生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解 – 单独配制的试剂：
不定芽型（adventitious bud type)：
• 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植 株的方式。 FLash
• 技术关键：打破顶端优势， 促使腋芽增殖并促其生根。
• 特点：繁殖率高、保持物种 的遗传稳定性，多用于林木 的繁殖。
• 铁盐与EDTA • CaCl2
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前P2826
以KNO3为例
1L培养基需要量为19g。
在配制母液时，增加10倍量，为190g。 在母液中的浓度为190g/L，即0.19g/ml
在配制培养基时，取10ml， 10ml×0.19g/ml=19g
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回P26
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3.1.3.4 植物细胞工程培养基配制
器官型(organ type)
• 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不 定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 • 技术关键：对培养基要求高，控制好激素 浓度，避免愈伤组织发生。 • 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。 三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、 丝石竹等
第3章 植物组织与器官培养
• 植物组织培养：将离体的植物组织（器官、 细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条 件，长成完整植株的技术。{诱发产生愈伤 组织、潜伏芽} • 植物器官培养： 将诱导的或植株 上原有的各种器官， 放在无菌的人工环境 中让其进一步发育， 最终长成幼苗或大量繁殖的过程。
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• 离体繁殖是建立在 体细胞系的基础上， 是在人工控制的环 境条件下，不会造 成性状分离，也不 会退化，同时还可 避免病虫害的侵染。
手指玫瑰
•由根组织培养的蒲 公英幼苗
植物离体无性繁殖的方式
• 器官发生型(organogenesis type) • 胚状体发生型(embryogenesis type) • 不定芽型（adventitious bud type) • 器官型(organ type) • 原球茎型(protocorm type) • 球茎芽型 • 块茎型 • 鳞茎型 • 孢子型 • 根茎型 • 微枝扦插型
– 常用的有6-BA、 KT 、 ZT
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BA分别为 0, 0.1, 5mg/L
NAA分别为 0, 0.1, 5mg/L
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（三）赤霉素类
主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植 株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采 用过滤除菌，并用酒精溶解。
• 脱落酸
抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激 素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。
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3.1.4.2 褐变问题
• 成因
– 酶促----酚氧化成醌及聚合 – 非酶促----醌聚合
• 时段
– 初代培养 – 继代培养
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减轻褐变现象发生的方法
① 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外 植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 ② 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温 度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 ③ 使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗 氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 ④ 材料预处理和细胞筛选 ⑤ 使用吸附剂 0.1%-0.5%的活性炭、PVP对防止褐变也有较为 明显的效果。 ⑥ 连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转 移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便 会得到控制或大为减轻。
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培养基分类
• 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以 下4类：
①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、 细胞及原生质体培养）；-MS ②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科 和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5
③中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H
④低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好 39
培养基及器皿消毒灭菌问题
培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间 容器容积 121℃下所需的最 （mL） 少灭菌时间(min） 20~50 75 250~500 1000 1500 2000 15 20 25 30 35 40
根茎型
• 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为 组织培养的最佳外植体 • 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢 子型快 • 肾蕨等
微枝扦插型
• 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 • 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 • 葡萄、杨树
3.1.3 培养基
3.1.3.1 无机盐
无机盐 无机元素
水
培养基的组成
大量 元素
微量 元素
有 激 其 机 素 它 元 素
•大量元素(使用浓度大于0.5mmol/L) 2013-5-28 •微量元素(使用浓度小于0.5mmol/L)
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3.1.3.1 无机盐
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3.1.3.2有机物
– 氨基酸类 重要的有机氮源
– 维生素类 以辅酶形式参与植物细胞代 谢活动，对生长、分化具有很好的促进 作用 vb1， vb6 – 糖类 主要的碳源—蔗糖？ – 天然有机添加物类 CM（椰乳）、马 铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等
• 近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、 杨树等已在种苗生产上广泛应用。
植物离体无性繁殖的意义（优越性）
繁殖速度快，经济效益高 占用空间小，不受地区季节限 制，便于工厂化育苗 可以繁殖各种珍稀、涉危苗木
• 离体繁殖周期： 1～3个月 • 繁殖系数：几 十～几百倍 • 又称快繁
利于筛选突变体，为育种服务
植物离体无性繁殖
• 简称离体繁殖（in vitro propagation)、微 型繁殖（micropropagation)，是指利用离体 培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶 片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养， 并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方 法（技术）。 • 用这种方法得到的植株群体称单株无性系。 (来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同)
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培养基灭菌
培养基组成中若含有遇热易分解物质， 如 生长调节物质、维生素、尿素、酶等 ，则必须用过滤法除菌。 过滤除菌时，使用孔径为0.22~0.45μm 或更小的细菌滤膜。 过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器 进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌， 灭菌温度不超过121℃。
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增殖、分化
基 本 程 序
逐步过渡
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胚状体发生型(embryogenesis type)：
• 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱 分化形成胚状体再成苗的方式。 • 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及 萌发率和提高胚状体同步化率。 • 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构 完整，繁殖系数高；遗传性稳定。 甘蔗、胡萝卜、石刁柏等
器官发生型(organogenesis type)：
• 诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培 养形成芽、根再生成植株的方式。 • 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早 期挑选，使其来源尽量一致。 • 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再 生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。
芦荟、烟草、油菜等
材料灭菌 无菌母株制备 器 官 发 生 型 培养基筛选 培养基中激素配比 激素种类及浓度 植株再生及鉴定 基本培养基组成 渗透压 炼苗和移植
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蔗糖浓度分别为0、1%、5%
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3.1.3.3 调节物质
（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、 诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的 细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽 的萌发与生长、胚状体的产生等。 –常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA
原球茎型(protocorm type)
• 兰属特有的方式， 即外植体经培养 产生原球茎，再 直接长成植株。
球茎芽型
• 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽， 一端出芽一端出根
• 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入 土中种植
唐 观 叶 海 棠
菖
蒲
叶 柄 表 面 遗 产 传 生 性 圆 较 球 稳 形 定 小 ， 突 球 球起 观 茎 茎— 叶 芽 芽— 海 可 型球 棠 直 茎 接 芽 放 ， 入 一 土 端 中 出 种 芽 植 一 端 出
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玻璃化的解决方法
1. 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的 水势； 2. 减少培养基中NH4+浓度； 3. 增加光照； 4. 增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减 轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 5. 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻 试管苗玻璃化的现象发生； 6. 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加 入适量脱落酸。
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3.1.4 植物组织培养问题分析
3.1.4.1试管苗玻璃化现象（vitrification） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失 调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形 态异常的现象。 • 玻璃化苗绝大多数为
来自茎尖或茎段 培养物的不定芽。 • 通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然 2013-5-28 形成玻璃化苗。
块茎型
• 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分 化出芽和根 • 块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖 移栽，成活率高 。 • 花叶芋
鳞茎型
• 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 • 在试管内形来自百度文库小鳞茎需较长时间 • 百合 郁金香
孢子型
• 用成熟或未成熟的孢子进行培养 • 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时 间较长 狼尾蕨 • 地钱