肝星状细胞

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中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2007 Feb; 23 (2)
中国 图 书 分 类 号 : R2332; R 329125; R 392111; R 39412; R 575120212; R 575120513; R 97716 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 - 1978 (2007) 02 - 0177 - 04 摘要 :目的 观察 15d2PGJ2 上调过氧化质体增殖物激活受 体 γ( PPARγ)表达以及对肝星状细胞 ( hepatic stellate cell, HSC)增殖凋亡的影响 。方法 体外培养 HSC2T6 细胞 , 取 对数生 长 期 的 细 胞 , 应 用 1、2、3 μmol ·L - 1 不 同 浓 度 的 PPARγ激动剂 15d2PGJ2 作用 24 h,同时以不加药物只加无 血清培养基做为对照组 , 24 h后应用 RT2PCR 的方法观察分 析各组间肝星状细胞 PPARγ mRNA 表 达 的 变 化 , W estern blot检测相应的胞质内 NF2κB 抑制蛋白表达 。M TT检测 HSC增殖 ,吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡 ,流式细胞仪分析 细胞周期 。结果 经 15d2PGJ2 处理的 HSC 细胞中 PPARγ mRNA 表达比例上调 ; 胞 质 内 NF2κB 蛋 白 表 达 明 显 抑 制 。 M TT结果显示不同浓度的 15d2PGJ2 对 HSC2T6 细胞的增殖 均有抑制作用 ,以 2μmol·L - 1组最为明显 ;吖橙啶染色显示 经 PPARγ激动剂处理组凋亡细胞数明显增多 ,流式细胞仪 结果显示 15d2PGJ2 处理组细胞产生了 G1 期阻滞作用 。结 论 15d2PGJ2 能够上调 PPARγ表达并抑制 HSC2T6增殖及 诱导其凋亡 ,其诱导凋亡机制可能与抑制 NF2κB活性有关 。
中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2007 Feb; 23 (2) : 177～80
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15d2PGJ2 对肝星状细胞增殖和凋亡的影响
康 谊 1 ,王天才 2 ,李修岭 1 ,杨玉秀 1 ,尚 佳 1
(1. 河南省人民医院消化内科 ,河南 郑州 453000; 2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科 ,湖北 武汉 430030)
autologous whole blood into the right basal ganglia and were killed 6, 24, 48 or 72 h later. D ry2wet2weighting technique, zymologic, immunohistochem ical and W est2 ern blot methods were used to exam ine changes of wa2 ter content, Na+ and K+ contents, glial fibrillary acid2 ic p rotein ( GFAP) 2positive cells and exp ression of oc2 cludin, which is a tight junction ( TJ ) 2associated p ro2 tein. Results Compared w ith sham operation group , contents of water and Na+ were significantly higher ( P < 0105 ) , the GFAP2positive cells were significantly more ( P < 0105 ) , and the content of K+ and the ex2 p ression of occludin were significantly lower ( P <
关键词 : 15d2PGJ2 ;过氧化质体增殖物激活受体 γ; 肝星状细 胞 ;凋亡 ;核因子 κB
收稿日期 : 2006 - 09 - 09,修回日期 : 2006 - 11 - 25 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (No 30271170) 作者简介 :康 谊 (1971 - ) ,男 ,博士 ,主治医师 ,研究方向 : 肝纤维
0105) in the ip silateral hem isphere of the model group. Compared w ith model group , contents of water and Na+ were significantly lower ( P < 0105 ) , the GFAP2 positive cells were significantly less ( P < 0. 05 ) , and the content of K+ and the exp ression of occludin were significantly higher ( P < 0105) in the ip silateral hem i2 sphere of sodium aescinate group. Conclusion s Sodi2 um aescinate m ay lessen and (or) delay the genesis of brain edema induced by intracerebral hemorrhage, and imp rove the p rognosis. Key words: intracerebral hemorrhage; brain edema; occludin; sodium aescinate
化发病机制 ,通讯作者 , E2mail: phd_kang@ hotmail. com; 王天才 (1941 - ) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 : 肝纤 维化发病机制 , Tel: 027282662576
组织的稳态 、器官的形成 、生长发育等生理过程
不仅需要通过细胞的增殖以增加新的细胞 ,而且需 要通过凋亡清除机体无用的细胞 ,因此 ,细胞凋亡是 机体内细胞生理性的调节机制之一 ,通过凋亡清除 多余和有害的细胞 ,与细胞分裂增殖一起调控组织 器官的细胞数目 ,保证机体的正常发育与生长 。研 究发现 ,在肝纤维化进展过程中肝星状细胞 ( hepatic stellate cell, HSC)有丝分裂及凋亡均增加 ,但以增殖 为主 ;而在逆转阶段凋亡占优势 ,使 HSC失去净增 加 , HSC凋亡与转化激活状态密切相关 ,对这一过 程的调控机制尚无一致的定论 [ 1 ] 。本研究通过观 察 PPARγ表达上调对 HSC增殖凋亡的影响 ,旨在 探讨 HSC增殖凋亡的调节机制 ,为指导抗肝纤维化 治疗策略提供实验基础 。 1 材料与方法 1. 1 实验材料 大鼠肝星状细胞株 HSC2T6 购自 上海中医药大学肝病研究所 ,兔抗鼠的 NF2κB p65 亚单位多抗购自美国 Santa cruz公司 , PPARγ的激 动剂 15d2PGJ2 为美国 Caymen公司产品 ,购自晶美 公司 ,溶于二甲基亚砜 ,并充入氮气于 - 20℃保存 。 其余分生试剂均为 Promega公司产品 。 1. 2 细胞培养及分组 大鼠肝星状细胞株 HSC2T6 生长于体积分数为 10%小牛血清及 1 ×105 IU ·L - 1 的青霉素 、100 m g·L - 1的链霉素的 DM EM 培养液 中 ,在 37℃, 5% CO2 、水饱和蒸汽的条件下进行培 养 。分为对照组 、15d2PGJ2 处理组 ,处理组加入浓 度分别为 1、2、3 μmol·L - 1的 15d2PGJ2 , 以不加药
1. 5 M TT 法 检 测 细 胞 增 殖 取 对 数 生 长 期 的 HSC2T6细胞 ,用 011 g·L - 1 EDTA 消化后制成 5 × 108 ·L - 1的细胞悬液 ,以每孔 200μl接种于 96孔平 底培养板上 , 置于 37℃、5% CO2 及饱和湿度的培 养箱中 , 24 h后加入不同浓度的 15d2PGJ2 , 以不加 药物而加等体积的无血清培养基为空白对照组 ,每 组设 3个复孔 ,分别于 24、48、72 h时每孔加入 5 g ·L - 1的 M TT 10μl,并于 37℃温育 4 h后小心吸弃 上清 ,每孔加入 DM SO 100μl充分混匀 , 用 TRCAN 酶标仪 (American research公司产品 )于 570 nm 处 测吸光度值 (A 值 ) ,以 3复孔的平均 A 值为相应的 A值。 1. 6 吖橙啶染色法检测 HSC 2T6 细胞凋亡 取对 数生长期细胞 ,加入不同浓度的 15d2PGJ2 ,以仅加入 等体积的无血清培养基作为对照组 ,作用 48 h,分别 收集各组细胞 。以 10 g吖橙啶溶解于 100 m l PBS 中 , pH值调整至 418～610,滤过 , 4℃避光保存 。将 各组细胞调整为浓度为 1 ×1010 ·L - 1细胞悬液 ,吸 取 95μl细胞悬液 ,加 5μl吖橙啶染液混匀 ,吸 1滴
物而加等体积的无血清培养基为对照组 。 1. 3 RT2PCR检测 PPARγm RNA 的表达 各取 1 ×106 细胞 ,按 TR IZOL试剂盒说明书用一步法提取 总 RNA ,测定 RNA 的浓度及纯度 ,逆转录反应条件 参照试剂盒说明 ,将逆转录产物 5μl加入 PCR反应 液中 , PCR反应液如下 : 10 ×buffer 5 μl, 25 mmol· L - 1 M gC l2 3 μl , 目的引物各 2 μl , 10 mmol·L - 1 dNTP 1μl ,用无菌水补足 20μl体积 。 PCR反应条 件为 95℃变性 5 m in后 ,按 95℃ 1 m in变性 , 55℃ 1 m in退火 , 72℃ 2 m in延伸 3步组成的 32个循环 ,最 后 72℃延 伸 10 m in, 反 应 物 经 凝 胶 电 泳 检 测 。 PPARγ的 引 物 序 列 为 上 游 引 物 : 5′2TGATATCG CCACTGGAACC23′, 下 游 引 物 : 5′2GTCCTCTCAGC TGTTCGCCA 23′,β2actin 上游引物 : 5′2ATCATGTTT2 GAGACCTTTCAACA 23′, 下游引物 : 5′2CACCTCTTT2 GCTCCGAAGTCCAA 23′, PCR 反应产物 10 μl凝 胶 电泳 显 像 , 应 用 美 国 UVP 公 司 的 凝 胶 成 像 系 统 ( GDAS21200 ) 经行荧光灰度分析 , 用 β2actin 作内 参 ,进行半定量分析 。 1. 4 W estern Blot检测 NF2κB蛋白表达 取 30 μg胞质蛋白以 12% SAD 2PAGE凝胶电泳分离 。电 转移蛋白至 PVDF膜 , 5%脱脂奶粉封闭过夜 ,加入 抗 NF2κB 多抗 ( 1 ∶200)于 4 ℃封闭袋中孵育 2 h; 二抗 (辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 抗 体 , 1 ∶ 4 000)孵育 1 h。化学发光法显示结果 ,压片曝光 。 凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带灰度 。
混合液点于洁净的玻片上 ,直接用盖玻片封片 ,荧光 显微镜下观察 ,每张玻片取 5个视野 ,每个视野计数 100个细胞所含凋亡细胞数 ,取其平均值 ,计数细胞 凋亡率 。 1. 7 流式细胞仪检测 HSC 2T6 细胞周期 细胞培 养和实验分组同上 ,每组设立 3份标本重复 ,具体实 验步骤如下 。配置 P I染液 ,浓度为 100 mg·L - 1 ,加 入 RNase 100 mg·L - 1 , 4℃避光保存 ,收集各组细胞 2 ×106 ·L - 1 , 500 ～1 000 r·m in- 1 , 5 m in去上清 , 3 m l磷酸盐缓冲液 ( PBS)洗涤 1次 , 将细胞团缓慢加 入体积分数为 70%乙醇固定 4 h, PBS洗去固定液 , 400目筛网过滤 , 500～1 000 r·m in - 1离心 5 m in去 上清 ,加入碘化丙锭 ( P I)染液混匀 , 4℃避光作用 30 m in,用 FACS400型流式细胞仪进行检测 ,观察细胞 周期分布情况 。 2 结果 2. 1 RT2PCR 检测 HSC 2T6 中 PPARγ m RNA 的 表达 mRNA 表达强度用平均吸光度 A 值表示 , A 值越 高 表 达 越 强 。结 果 显 示 对 照 组 及 不 同 浓 度 15d2PGJ2 处理组细胞中均有 PPARγmRNA 的表达 , 随着 15d2PGJ2 作用浓度的增加 , PPARγmRNA 表达 增强 , A 值 分 别 为 01513 ±01031、01697 ±01018、 01674 ±01032,且同对照组 (A 值为 01198 ±01021) 相比 ,经方差分析检验差异有显著性 ,如 Fig 1。