鼠肝星状细胞分离方法汇总
改良的大鼠肝星状细胞分离方法
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２１ ０ １年 ４月 第 ８卷第 １ ２期
・
实验 研 究 ・
改 良的大 鼠肝 星 状 细胞 分 离方 法
洪 伦 ， 海 波 ， 岸 柳 ， 守 荣 雷 唐 沈
中南大 学 湘雅 三 医院 消化 内科 ， 湖南 长 沙
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验
青链霉素
防止细菌污染。
EDTA
用于螯合金属离子，防止细胞 粘附。
02
实验操作流程
大鼠肝星状细胞分离
准备器材
麻醉大鼠
包括手术器械、注射器、离心管、细胞筛 等。
使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其固定在 操作台上。
解剖大鼠
细胞分离
切开大鼠腹腔，暴露肝脏，并小心分离出 肝组织。
将肝组织剪成小块，放入含有消化酶的离 心管中，震荡孵育，然后离心，弃去上清 液，获得肝星状细胞。
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的 实验
汇报人： 日期:
目 录
• 实验准备 • 实验操作流程 • 实验数据分析 • 实验结论与讨论 • 参考文献与致谢
01
实验准备
实验材料准备
大鼠
健康雄性SD大鼠，体重100-150g。
细胞培养瓶
T25或T75培养瓶，用于细胞培养。
解剖器械
手术刀、手术剪、镊子、血管钳等。
细胞周期分析
通过分析细胞的周期分布，可以了解细胞增殖和凋亡的平衡状态。可以使用 DNA含量测定、细胞计数等方法进行测定。
04
实验结论与讨论
结论概述
实验成功分离出大鼠解析
采用酶消化和贴壁培养方法，成功分离出高纯度的肝星状细胞。
细胞形态完整，活性良好，可用于后续实验。
参考文献2
作者2, 等. (2015). 改进的 大鼠肝星状细胞分离与培 养方法. 生物医学工程学 杂志, 32(1), 120-126.
参考文献3
作者3, 等. (2018). 大鼠肝 星状细胞的体外培养及药 物干预研究. 中国实验动 物学报, 26(5), 635-641.
致谢
感谢实验室的老师和同学们在 实验设计和操作过程中的指导 和帮助。
肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案
肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】主要试剂Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。
沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。
将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
小鼠原代肝细胞分离方法
小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。
本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。
材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。
b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。
c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。
2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。
b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。
3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。
b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。
4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。
b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。
c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。
消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。
5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。
b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。
d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。
6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。
b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。
c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。
讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。
本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。
该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。
原代肝星状细胞的分离
小鼠HSCs 的分离1) 实验前准备：37℃水浴锅内预热D-HanK’s溶液、HBSS溶液(含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶)及含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶和20 μg/mL 的DNA 酶的HBSS 溶液；2) 小鼠准备：取体重约25~30 g 的雌性Colgalt2-/-小鼠与Colgalt2+/+小鼠，禁食12 h，自由饮水；3) 麻醉与固定：腹腔注射8‰的戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后固定在超净台内，75%乙醇消毒腹部；4) 依次切开小鼠皮肤、腹膜后暴露腹腔，将小鼠胃肠移至腹部左侧，充分暴露门静脉和下腔静脉。
整个过程均按照手术无菌原则执行；5) 自门静脉远端刺入静脉输液针，另一端连接50 mL 注射器，注射预热的D-HanK’s 液。
确定插入成功后，剪开下腔静脉。
以7-10 mL/min 的速度灌注D-HanK’s 液，灌注约30 mL。
观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后停止灌注；6) 开始灌注预热的含IV 型胶原蛋白酶的HBSS 溶液，速度为3-5 mL/min，灌注10 min 左右。
直至肝脏变软、变脆，肝脏表面呈现裂隙状，压之凹陷不易恢复时结束灌注；7) 摘除胆囊后，剪断门管区韧带和镰状韧带，取下肝脏，放入无菌平皿中。
生理盐水冲洗，剔除肝包膜、血管及纤维结缔组织；8) 剪碎肝组织及震荡消化：将肝组织剪成小碎块，加入已配制好的HBSS液20 mL(含0.3 mg/mL的IV 型胶原酶和1 μg/mL的DNAase I)，37 ℃条件下震荡消化25 min；9) 用200 钼的滤网过滤，1500 g 离心7 min，弃上清；10) 20 mL 冰的不含FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬，500 g 离心5 min。
弃去沉淀，即去除肝细胞；11) 离心上清液，1500 g，7 min，吸取沉淀（即肝非实质细胞）；12) 加入2 倍体积的18%Nycodenz离心液，混匀后，小心加入冷的不含FBS的DMEM (约2 mL)；13) 离心：2600 g，22 min。
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究目的:探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。
方法:采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心(20 000 r/min)和细胞悬液低速离心(40×g)去杂质后得到肝星状细胞。
台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。
结果:肝星状细胞的得率为(3.6±0.1)×107/肝,肝星状细胞存活率为(92.8±0.8)%,对培养24 h 的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为(96.2±0.5)%。
结论:本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。
[Abstract] Objective: To explore an economical and easy method for isolating and culturing the rat hepatic stellate cells to study the pathogenesis of hepatic fibrosis. Methods: Adult healthy rats’ isolated livers were perfused by cyclophorase liquid in vitro. After the density gradient centrifugation of nycodenze at the speed of 20 000 r/min and the low-speed centrifugation (40× g) of cell suspension, the higher purity hepatic stellate cells were obtained. The refusal rate of cells could identify the rate of live cells in the trypan blue test; desmin and GFAP immunocytochemistry (double antibodies and single staining) were used to identify the purity of hepatic stellate cells. Results: The yield of hepatic stellate cells was (3.6±0.1)×107 per liver, the survival rate of hepatic stellate cells was (92.8±0.8)%, HSCs cultured for 24 hours were identified by desmin and GFAP, single staining the rate of positive cell was (96.2±0.5)%. Conclusion: The improved method increases the purity of the primary rat hepatic stellate cells on the base of promising the yield in order to study the primary hepatic stellate cells and liver fibrosis.[Key word] Hepatic satellite cells; Cell isolation; Primary culture; Cell identification肝星状细胞(hepatic satellite cells,HSCs)是肝脏内的一种非实质细胞,占整个肝脏的8%～13%[1-2]。
改良小鼠肝星状细胞的分离、培养及性质鉴定
图圈圆
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第２ ２卷第 ６期
２ｌ ０ ０年 １ １月
肝
胆
胰
外
科
杂
志
Ｖｏ． ２ １ ＮＯ ６ ２ ．
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｐ ｔｐ ｎ ｒａｏ ｉａｙＳ ｒｅｙ ｏ ｒａ ｏ Ｈｅ ａｏ ａ ｃｅ ｔｂｌ ｒ ｕｇ ｒ ｉ
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改 良小 鼠肝星状细胞 的分离 、 培养及性质鉴定
［ 关键 词 ］ 肝 星状 细 胞 ； 离 ； 养 ； 定 ： 鼠 分 培 鉴 小
［ 图 分类 号 ］ Ｒ ５ ． 中 ６ ７３ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 文章 编 号 ］ １ ０ —１ ５ ２ １ ０ — ４ ７ ０ ０ ７ ９ ４《０ ０）６ ０ ５ — ３
ＦｒｔＡｍｌａ ｄ ｝ｆｐｔｌ【 Ｗｅｌｈ ｌ １ｅ ｉａ ｏｌｇ ｉ ｉ ｅ ｌｓ ｉ ｝ ｓ （ ￣ ｎ ｆ ｌ ｏ１． ｄｃ ｌＣ ｌ ｅ．Ｗｅｌｈ ｌ ３ ５ ０ ｚ ｉ ｅ ｔ ｏｌ ２ ０ ０ ｚ
小鼠原代星状细胞提取方法
大鼠原代星状细胞提取方法一、原位灌注：1、1ml 5%水合氯醛麻醉大鼠，腹壁酒精消毒，十字切口打开腹腔，用湿棉签将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉。
2、将充满灌流液的针（0.45或0.55的头皮静脉针）经小口插入门静脉（不要插的过深），止血夹或线结扎，软管部分用纸胶布固定以免滑脱。
3、灌注I液灌注在肝脏迅速发白后剪断下腔静脉，肝脏在全部灌注完后可见白色纹理。
可以注射器灌注，也可以使用专门的大鼠灌注器。
先灌注I液：5min\37度\8ml/min。
可稍快再灌注II液：10min\37度\5ml/min。
一定要慢，防止门静脉破掉二、梯度离心：1、灌流结束后，将取适量（直径不超过5cm）肝脏移至无菌培养皿中（镊子泡过酒精，尽量把血管和胆管、胆囊留下），移至超净台，加入少量（5ml左右）灌注II液，剪碎肝组织（2mm，尽可能碎），剔除其他组织。
2、将搅碎的肝组织倒入50ml的离心管，加入灌注II液至30ml，加入12mg pronase 和0.6mg DNase，37度水浴消化12~15min，消化过程中每2~3min拿出来轻轻震荡或摇晃。
3、加入15ml 4°C含10%FBS的DMEM终止消化。
4、70um过滤网过滤：用无菌镊子夹出过滤网，放入10CM无菌培养皿中，将液体用枪打入，有较多沉淀时用1ml无菌注射器尾部粗糙不平部位去研磨，留下的都是一些血管等白色物质后即可停止。
5、将过滤后的液体转移至50ml离心管中，静置10min，肝细胞较重沉淀下来，收集悬浮液转移到新离心管中，400g，7min，使所有细胞都沉下去。
6、吸掉悬浮液，加入4~5ml 15%optiprep液，重悬后转移至15ml离心管（注意不要滴到壁上），缓慢倾斜至与水平面夹角30度，缓慢加入5ml 11.5%optiprep（枪头竖直指向离心管口附近，使液体缓慢流进去），同法再加5ml HBSS溶液。
加完后慢慢竖直可见三种液体明显分层，记住11.5%optiprep与HBSS溶液的分层处。
小鼠肝星状细胞的分离纯化新方法的建立与应用
ｍ ａ公 司 ） 淋 巴细 胞 分 离 液 （ 国 医 学 科 学 院 生 物 工 程 医 学 研 、 中 究所）Ｄ 、 ＭＥ 培 养 液 干 粉 （ Ｂ Ｏ 公 司 ） 小 牛 血 清 （ 季 青 Ｍ ＧＩＣ 、 四 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ） 鼠结 蛋 白 单 克 隆 抗 体 （ ＡＫ ） 、 Ｄ （ 公
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１ ５ １ １ 麻 醉 与 消 毒 用 ２ 戊 巴 比 妥 钠 按 ４ ／ ｇ腹 腔 ．．． ０ ｍｇ ｋ 注射 小 鼠 。麻 醉 后 常规 固 定 ， 小 鼠 于超 净 台 内 ， ５ 酒 精 消 置 ７ 毒腹 部 ， 外 线 照 射 ２ ～ ３ ｎ 紫 Ｏ ０ ｍｉ 。 １ ５ １ ２ 灌 流 “ ” 切 口打 开腹 腔 ， 肠 管 于 腹 腔 左 侧 ， ．．＿ 十 字 推 暴
了一 种 实用 的 小 鼠 ＨＳ 分 离方 法 ， 用 于 肝 纤 维化 和 原 代 ＨＳ 的 生 物 学 行 为 研 究 。该 方 法 简便 、 用 、 Ｃ 可 Ｃ 实 高产 。 需 特 殊 设 备 ， 不 便
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。
原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。
以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。
实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。
b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。
c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。
2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。
b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。
c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。
d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。
e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。
3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。
b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。
c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。
d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。
4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。
b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。
c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。
d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。
小鼠肝星状细胞分离
分离前准备：分离前晚小鼠禁食不禁水前灌流液NaCl 8g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06 g, NaHCO3 g，NaHCO3 0.35 g,加超纯水至终体积l L酶配制液Nacl 8 g, Kcl 0.4 g, CaCl2 0.56 g, Na2HPO4·12H2O 0.151 g, NaH2PO4·2H2O 0.078g, HePes 2.38g, NaHCO3 0.35g, 溶解到1L 超纯水中含钙GBSS液：KCl 0.37 g，CaCl2 0.225l g，MgCl2·6H20 0.21 g，MgS04 0.0342g，KH2P04 0.03g，NaHC03 2.27g，NaH2P04 0.1196g，葡萄糖1.0 g，加超纯水至终体积1L链酶蛋白酶E灌注液：130 mg, 酶配制液100 ml胶原酶灌注液：Ⅳ胶原酶30 mg，酶配制液100ml震荡消化液：Ⅳ胶原酶12mg, 链酶蛋白酶E 5mg，Dnase 5mg，酶配制液50ml28.7% Nycodenz分离液：Nycodenz粉末28.7g，含钙GBSS 100ml以上液体0.22um 过滤除菌，置于37度水浴预热分离：10% 水合氯醛0.5ml麻醉小鼠，固定，75%酒精消毒，开腹，暴露肝门静脉，游离门静脉，埋线，24G 留置针进针，固定，打开蠕动泵，15ml/min灌注，剪开下腔静脉。
流出液体澄清后，换链酶蛋白酶E灌注液，10ml/min,20min后换胶原酶灌注液，灌注30min，剪下肝脏，撕碎置于震荡消化液，加入1ml双抗，37度恒温摇床150rpm 30min。
200目过滤。
4度预冷DMEM中和。
4度750g 7min离心，弃上清，重复一次。
4度50g 3min,弃沉淀，4度750g 7min离心，弃上清，重悬，加Nycodenz调整密度1.04-1.055g/ml 之间，上铺1ml无钙GBSS，20度1350g 15min，吸取白色细胞层，10%DMEM 重悬，4度750g 5min，弃上清，20%FBS DMEM培养，24小时换液。
大鼠肝脏星形细胞的分离培养及鉴定
【 要 】 目的 摘
技 术支 持 。方 法 ９ ％。结 论 ８
建 立大 鼠肝 星形 细胞 （ ｐ ｅａ ｌ， Ｓ ） ｝ ａｃ ｔｌｅ ｅｓＨ ｃ 的体 外分 离及 培养方 法 ， 进行 肝纤 维化 的实 验研 究 提 供 ｓｌｔｃ ｌ 为
【 关键词 】 肝 脏星 形 细胞 ； 细胞培 养 ； 定 鉴
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鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。
立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。
加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。
37℃5％C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4℃800g平抛离心30分钟。
吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。
24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：[动物]雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。
肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案
肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】主要试剂Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin 抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。
沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。
将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1％链霉蛋白酶溶液并调PH 7.35),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
建立一种改良方法分离大鼠肝星状细胞
（ｅｔｆＧ ｓｒ ｎｅｏｏｙ ｈ ｆ ｌｔｄＫ ｎ ａＨｏ ｉｌ Ｋ ｎ ｎ ｄｃ ｎｖｒｉ ， Ｄｐ． ａｔ ｅｔｒｌ ，ＴｅＡｆ ｉｅ ｕ ＂ ｓ ｔ ｕｍｉ Ｍｅｉ Ｕ ｉｅ ｔ ｏ ｏ ｇ ｉａ Ｈｕ ｐ ａｏ ｆ ｇ ｌ ａ ｓｙ
Ｋ ｎ ｉｇＹ ｎ ａ ５ ０ ２ ｈｎ ） ｕ ｍ ｎ ｕ ｎｎ６ ０ ３ ，Ｃ ｉａ
传代后 ＞ ５ ９％．结论
Ｈ Ｃ得率和纯度． Ｓ
肝脏离体后消化 能达 到在体消化 同样 的效果 ，应用 Ｎ ｃｄｎ 密度 分离介质可获得满 意的 ｙｏｅｚ
［ 关键词］分离 ；大鼠；肝星状细胞
【 中图分类号］Ｒ ７ ． ［ ５ ５ 文献标识码］Ａ ［ ２ 文章编号］１０ —４ ０ （０ ２ ６ ０ ８— ４ ０ ３ ７ ６ ２ １）０ —０ １ ０
ｓ ｐ ｌｍｅ ｔ ｄ ｗｉ ｆ ｔｌ ａｆ ｅ ｕ ｎ ｅ ７ ｃ ｎ ａｎ ｄ ５ ＣＯ ９ ％ ａｒｉ ｃ ｂ ｔ ｒ Ｒｅ ｕｔ Ｔ ｅ ｈ ｒ ｅ ｔ ｕ ｐ ｅ ｎ ｅ ｔ ｌ ％ ｅ ａ ｃ ｌ ｓ ｒ ｍ ｕ ｄ ｒ ３ ℃ ｏ ｔｉ ｅ ％ ｈ ０ ， ５ ｉ ｎ ｕ ａｅ ． ｓ ｌ ｓ ｈ ａ ｖ ｓ
昆明医科 大学学报
２ １ ，６） １ ～２ ０ ２ （ ：８ ０
ＣＮ 一 ｌ ４９ ５３ ０ ／Ｒ
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＫｕ ｍ ｉｇ Ｍ ｅ ｉａ ｉｅ ｓｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｎ ｄｃ ｌＵｎ ｖ ｒｉｙ ｏ
建立一种改 良方法分离大 鼠肝星状细胞
李 玉莲 ，宋 正 己 ，范 红 ，彭 伟 ，陈艳敏 ，万 苹 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 昆明 医科 大 学 附属 昆华 医院 消化 内科 ，云 南 昆明 ６０ ３） ５０２
ｉ ｍｍｕ ｏ ｕ ｒｓ ｅ ｃ ｔｉｉｇ ｉｅ ｔ ｅ ｎ ｓａ ｅ ｕ ｉ ｆＨＳ ． ＨＳ ｅｅ ａｔ ａｅ ｙ ｃ ｌ ｒ ｎ ｕ ｃ ａｅ ｎ ｆ ｏｅｃ ｎ ｅ ｓａｎｎ ｄ ｎｉ ｄ ａ ｄ ａ ｓｙ ｄ ｐ ｒｔ ｏ Ｃ ｌ ｉ ｆ ｙ Ｃ ｗ ｒ ｃｉ ｔｄ ｂ ｕｔ ｅ ｏ ｎ ｏ ｔｄ ｖ ｕ
大鼠肝星状细胞的简易分离法
第３３卷第４期２０１２年８月同济大学学报（医学版）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＴＯＮＧＪＩＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ）Ｖ０１．３３ＮＯ．４Ａｕｇ．，２０１２ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎｌ００８—０３９２．２０１２．０４．００７大鼠肝星状细胞的简易分离法・基础研究・朱欣彦，王胜兰，杨长青，杨文卓，张俊杰，孙龙娥（同济大学附属同济医院消化内科，上海２０００６５）’【摘要】目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上，探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。
方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化，经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。
台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率，结蛋白（Ｄｅｓｍｉｎ）免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。
结果肝星状细胞的得率为４．０Ｘ１０７以上，肝星状细胞纯度为９６％左右，肝星状细胞存活率为（９５．０±１．２）％。
结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法，结果稳定，细胞纯度较高，有利于进一步的生物学研究。
【关键词】肝星状细胞；细胞分离；原代培养【中图分类号】Ｒ７３５【文献标志码】Ａ【文章编号】１００８—０３９２（２０１２）０４—００３２—０４ＡｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｒａｔｌｉｖｅｒＺＨＵＸｉｎ・ｙａｎ，ＷＡＮＧＳｈｅｎｇ－ｌａｎ，ＹＡＮＧＣｈａｎｇ—ｑｉｎｇ，ＹＡＮＧＷｅｎ—ｚｈｕｏ，ＺＨＡＮＧＪｕｎ－ｊｉｅ，ＳＵＮＬｏｎｇ—ｅ（Ｄｅｐｔ．ｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＴｏｎｇｉｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇｊｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，。
Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６５，Ｃｈｉｎａ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ（ＨＳＣｓ）ｆｒｏｍｒａｔｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｏｂｔｍｎｅｄｆｒｏｍｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔＷｉｓｔａｒｒａｔｌｉｖｅｒｂｙｉｎｆｕｓｉｏｎｏｆｐｒｏｎａｓｅａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｖｉａｐｏｒｔａｌｖｅｉｎ；ｔｈｅｎｔｈｅＨＳＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｔｅｓｔ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆＨＳＣｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｙｉｅｌｄｅｄ４．０×１０’ｃｅｌｌｓ．ａｎｄｔｈｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｐｕｒｅＨＳＣｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（９６％）．Ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｗａｓ（９５．０±１．２）％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｓｉｍｐｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｒａｔｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ；ｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅ肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ，ＨＳＣ）是肝脏中的重要细胞之一，在肝纤维化和肝硬化中起关键作用。
小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法
小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法张强;陈曦;苏畅;张正筠;杨军;韦瑶;周光文;李宏为【期刊名称】《外科理论与实践》【年(卷),期】2009(14)1【摘要】目的:探索BALB/c小鼠肝星状细胞(HSCs)分离、纯化的可行方案,并评价依该法分离所得HSCs的生物学特性。
方法:经肝门静脉先用不含钙镁离子的Hank 液充分灌洗,再以浓度为1mg/mL的Ⅳ型胶原酶灌注BALB/c小鼠肝脏。
取肝后,完整分离后碾碎,37℃水浴振荡30min,Percoll连续密度梯度(60%)离心法分离、纯化HSCs,苔盼蓝染色检测HSCs活性,结蛋白免疫细胞化学鉴定HSCs,光镜观察体外培养HSCs的形态学变化。
结果:纯化后每只小鼠HSCs收获量约为(5.5±0.4)×105个,HSCs纯度>90%,HSCs细胞活率>90%。
结论:本实验建立的的分离纯化方案可获得高纯度高活率的小鼠HSCs。
【总页数】3页(P46-48)【关键词】肝星状细胞;细胞分离;原代培养;小鼠【作者】张强;陈曦;苏畅;张正筠;杨军;韦瑶;周光文;李宏为【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院外科瑞金医院器官移植中心上海消化外科研究所【正文语种】中文【中图分类】R657.3【相关文献】1.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅;2.改良小鼠肝星状细胞的分离、培养及性质鉴定 [J], 俞富祥;苏龙丰;季世强;张胜初;余盼攀;张启瑜3.大鼠原代肝星状细胞分离、鉴定及培养方法的研究 [J], 张玉;周曦;易龙;马鑫;张乾勇;糜漫天4.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅5.日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养 [J], 曹蕴;李玉云;夏超明;许静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。
立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。
加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。
37℃5％C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4℃800g平抛离心30分钟。
吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。
24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：[动物]雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。
试剂：胶原4、DNase1、DMED、胎牛血清、Percoll、链酶蛋白酶2、分离当日氯胺酮0.2ml/100ml体重、甘肃150U肌肉注射麻醉3、严格消毒，置于无菌超净台，仰卧位固定4、取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线，皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。
5、将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门出门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成，在双侧肾静脉上方游离肝下腔静脉。
6、肝上游离肝膈面，下压肝脏剪短镰状韧带至肝上下腔静脉。
7、将9号输液针插入肝门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。
同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉肝下腔静脉，开始原位灌注。
8、首先使用加葡萄糖1g/L、甘肃500U/L的D-Hank’s也200ml，经水浴加热到39℃，流苏20ml/min，尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出，9、使用酶灌注液0.05mol/L Ca2+、0.05%胶原4、D-Hank‘s液100ml，流速5ml/min，消化肝脏。
10、20min后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿，进入细胞室。
11、在培养皿中去除肝包膜，将肝脏粉碎成糊状，放入0.05%胶原4、0.001%DNase1和5.3%FCS-HI的PBS中，37水浴摇动30min，使肝组织充分得到消化12、将消化好的肝组织用200目筛网过滤，未通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，与培养液冲洗。
13、滤过好的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加入培养液只50ml，20℃100g离心5min，去除大部分肝实质细胞14、上清液转入另一离心管中350g离心10min15、去沉淀重悬于50ml培养液中，再次350g离心10min16、沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已铺好梯度的Percoll顶层17、Percoll的密度梯度分3层：由上至下依次为：20% 1.012g/ml 20ml35% 1.014g/ml 15ml50% 1.018g/ml 10ml18、铺好后4℃900g离心30min，轻轻取出，不要摇动液面，可见20%层中间有一混浊带19、用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml放入离心管20、及培养液至50ml，900g离心10min，沉淀重悬于10ml混合培养液中，加胎牛血清21、细胞计数，台酚蓝判断活力液体配制：1、预灌注液：葡萄糖1g/L、HEPES2.38g/L的D-Hanks，pH7.2-7.4，过滤除菌2、链酶蛋白酶（现用现配）：链酶蛋白酶50mg，D-Hank50ml3、胶原酶（现用现配）：胶原酶12.5mg，D-Hank50ml4、震荡液（现用现配）：链酶蛋白酶40mg，D-Hank50ml5、Nycodenze液：10.387%和18.8%两种浓度分离方法1、灌注：乙醚麻醉，碘伏消毒大鼠腹部，U形打开腹腔暴露肝脏，门静脉插管，预灌注液39℃灌注20ml/min至肝脏完全变白，输液管前段一1ml肝素稀释液代替，40℃链酶蛋白酶液和37℃胶原酶液5-10ml/min离体循环灌注各30min2、再次消化：将肝脏移入超净工作台已硅化的培养皿中，去除被膜，小剪刀剪碎，倒入有震荡液的硅化三角瓶中，水浴摇床震荡30min（200-250次），向三角瓶内加入4℃的DMEM20ml、DNase5ml，加D-Hank至45ml，充分轻轻吹打，离心弃上清，再重复1遍，弃上清，加DMEM约7.5ml，混匀悬液3、密度梯度50ml离心管，先加10.387%Nycodenze10ml，再将吸管深入到试管底部慢慢匀速加入18.8%的Nycodenze10ml，再在液面上缓慢加入细胞悬液20000r/min 离心25min 10℃加速离心后，可见上面的一层白色细胞层为未活化的星状细胞，小心吸出至2个15ml的离心管内4、洗涤提纯HSC向离心管中加入新的DMEM至12ml，充分吹打混悬，洗涤3次，用喊20%胎牛血清的DMEM悬浮，40g离心，弃沉淀。
5、培养方法取1滴悬液至计数板上，盖上盖玻片，在倒置显微镜下观察技术细胞1×106接种于6孔板，12h后换液，以后每3天换一次6、细胞活率鉴定台酚蓝拒染实验：取2滴细胞悬液加2滴0.4%台酚蓝，混匀，3min内计数活细胞数7、HSC纯度鉴定Desmin和GFAP免疫细胞组化鉴定在接种细胞前向培养孔内滴入1滴无菌PBS，将用多聚赖氨酸（细胞专用）包被的无菌盖玻片放入孔内，使其紧贴培养板，然后以1×105接种，24h后将盖玻片取出，4℃丙酮固定15min，自然风干，行desmin和GFAP免疫组化双抗单染色8、HSC自然活化形态学观察刚分离出的HSC边界清楚，细胞圆形，透亮，折光性强培养数小时后，见细胞部分贴壁，24h后细胞体积稍增大，折光性较前减弱48h后见细胞开始伸出伪足，有的呈梭行，有的蝌蚪形7d后细胞变长，胞体较大，呈现典型的纤维细胞样，14d后，细胞全部活化一种改良方法分离大鼠肝星状细胞1、大鼠用氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮75%酒精消毒3次，倒U剪开腹壁充分暴露肝脏及门静脉，18套管针内静脉穿刺并保留置管，先后用20ml注射器抽吸无消化酶喊125U/ml甘肃的37℃D-Hank和无甘肃的37℃Hank，经门静脉在体灌洗肝脏，同时剪断下腔静脉放血，肝脏灌洗至流出液无血迹，肝脏变灰白，保留置管迅速游离肝脏，离体后的肝脏在超净工作台先用喊0.05%胶原酶、0.1%连蛋白酶的37℃Hank25ml从门静脉和肝静脉处用注射器反复灌注消化至肝脏软化。
去除肝脏包膜和纤维组织，加入含0.05%DNase1的37℃Hank25ml磁力搅拌30,min，消化后的肝组织液200目筛网过滤得到粗细胞液，加入DMEM终止消化，500r/min 5,min低速离心去除沉淀肝细胞及细胞碎片，上清液用4℃12%Nycodenze连续梯度4℃3200r/min 17min分离不同比重细胞，小心吸取界面最上层的HSC，4℃DMEM1500r/min5min洗涤细胞，细胞用含20%胎牛血清的DMEM悬浮。
分离后的HSC接种于细胞培养皿，3d7d分别进行desmin SMA免疫荧光。
小鼠的肝细胞培养没有尝试过，我自己一直是做大鼠，方法还是比较成熟，成功率一般在80％以上，附上步骤，希望能对你有所帮助：1.Wistar大鼠，体质量180—220 g，普通块料喂养，随意饮水，室温1 8－22℃，每目光照1 2—1 4 h，术前禁食12 h．2.IV型胶原酶、地塞米松、胰岛素及HGF为Sigma公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品．3.大鼠用20 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(30 mg／kg)，同时腹腔内注射肝素钠溶液200 U．消毒皮肤后，取正中切口进入腹腔．显露门静脉后在距肝门2 cm处插入18号导管，导管与一次性输血器相接，后者连接输液瓶（如果不好放置，可以改用50ml注射器，但要注意控制好速度），先以30mL／min的速度输注无钙镁的Hanks液(含EDTA 1 mmol／L)200 mL，夹闭肝上下腔静脉，在肝下下腔静脉插入16号导管放出积血积液，再输注含0.5 g／L IV型胶原酶的Hanks液100 mL，输注速度为15 mL／min，取下肝脏,置于含4℃ Hanks液的平皿中，去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织(注意：千万不要用剪刀剪碎，会损伤细胞)，多层纱布过滤，制成细胞悬液，将此悬液以100目及200目不锈钢网过滤，以500 -1000rpm离心2 min,弃上清，以4℃ Hank液清洗并离心3次，用4 g/L台盼蓝进行染色判断细胞活率，用血细胞计数板计数细胞浓度并计算细胞产量．5.将分离、纯化的肝细胞用合成培养基(含RPMI 1 640 80 mL，新生小牛血清20 mL，HGF 5 ug／L，地塞米松l0 -7mol／L、牛胰岛素10 -8mol／L，青霉素100 kU／L，链霉素100 kU／L)稀释成0.5×109／L，在37℃，50 mL／L C02条件下培养，每24 h更换培养基1次，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况．大鼠肝星状细胞的浮力密度范围在 1.047-1.061g/ml左右, 分细胞的时候可以上限订的高一些, kupffer的在1.083-1.095,你可以根据这个去计算下你需要的剃度.但这只是大致的范围,具体到每个细胞来说,肝细胞也有密度小的，很多时候剃度离心下来,发现有些肝细胞也浮上来了。