肝星状细胞及其与肝脏疾病的关系

#讲座与综述#

肝星状细胞及其与肝脏疾病的关系

徐丹,卢大雷

作者单位:475000 河南省开封市医学科学研究所;475000 河南省开封市医用细胞生物学实验室

=关键词> 肝星状细胞;肝脏疾病;关系

=中图分类号> R 32912+8 =文献标识码> A =文章编号> 1674-3296(2010)06-0124-02 肝星状细胞(H SC)是细胞外基质(EC M )的主要来源细

胞,分为静止和活化2种类型[1]

。随着细胞学、分子生物学等基础医学科学的发展和应用,人们对H SC 的研究和认识不断深入,发现其在肝脏疾病中发挥着重要作用。本文就H S C 的生物学特性、活化及其调控以及H SC 与肝脏疾病的关系做一综述。

1 肝星状细胞的生物学特性

1.1 HSC 性质及功能 H SC 位于肝窦内皮细胞(SEC )和肝细胞之间的窦间隙狄氏腔内,其数量占肝脏细胞总数的15%,占肝脏间质细胞的1/3[2]。正常情况下HSC 表现为富含维生素A 脂滴的静止状态,其主要功能:储存脂肪,以供给肝细胞能量;代谢和贮存维生素A;通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环,从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力;合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分;合成基质金属蛋白酶(MMP )及其组织抑制剂(T I M P);表达细胞因子及受体。1.2 H SC 生物学特性肝脏损伤后,HSC 则激活成为肌成纤维样细胞-活化型,其生物学特征主要表现为:胞体增大,胞突伸展,胞质中脂滴消失,维生素A 含量减少;细胞大量增生,并且向肝损伤部位迁徙;表达A 2平滑肌蛋白,为活化型H SC 的标志;具有收缩功能,活化的H SC 合成内皮素增加,引起H SC 收缩,导致肝内微循环收缩和肝窦血管阻力升高;EC M 分泌增多,活化的H SC 是ECM 生产的主要来源;分泌多种细胞因子,表达多种受体,对化学因子刺激的敏感性增加;表达结蛋白、波形蛋白及神经胶原酸性纤维蛋白;释放MM P 及TI MP 。2 肝星状细胞的活化及调控

2.1 H SC 活化在1995年由德国的G ress ner 提出了H SC 激活的/三步模式0。炎症前期:由各种病因导致肝实质细胞损伤,产生多种细胞因子,通过旁分泌作用于H SC ,从而促使HSC 大量增殖;炎症期:活化的库普弗细胞、巨噬细胞及血小板释放多种细胞因子(TGF 2A 、TGF 2B )和血小板衍生生长因子(PD GF)等,进一步刺激HSC 增殖并向肌成纤维细胞(M FB)转化[3],其中PDGF 是最强的促进H SC 增殖的刺激因子;炎症后期:激活后的HSC 产生大量的细胞因子和生长因子并通过旁分泌和自分泌作用,进一步刺激未激活转化的HSC 转变为M FB 并合成EC M 。这时即使去除致病因子,肝纤维化仍可继续发展。

2.2 H SC 活化的调控

2.2.1 PDGF:目前认为PD GF 具有明显的促有丝分裂和刺激胶原及纤维连接蛋白合成的作用。H SC 既是PDGF 的产生细胞,又是PDGF 作用的靶细胞。而PDGF 是H SC 最强的有丝分裂原,能够强烈刺激HSC 的活化、分裂和增殖。

2.2.2 转化生长因子(TGF 2B 1):TGF 2B 1具有强烈的促HSC

合成EC M 作用,TGF 2B 1还可刺激HSC 的PD GF 受体的表达,增强PDGF 的作用;TGF 2B 1亦可通过抑制MMP 合成而抑制EC M 的降解。

2.2.3 肿瘤坏死因子2A (TNF 2A ):T NF 2A 能促进HSC 的激活,刺激EC M 合成并分泌多种细胞因子作用。另外,TNF 2A 通过增加H SC 中蛋白水解酶抑制物的合成,还可抑制EC M 的降解。Andus 等研究表明:T NF 2A 对活化的H S C 的增殖和凋亡均起到抑制作用,可能是慢性肝损伤时活化的H SC 寿命延长的内在机制。

2.2.4 胰岛素样生长因子21(I GF 21):I GF 21是一种细胞上类似胰岛素原的多肽促分裂原,能刺激H SC 的活化和增殖,通过对细胞外信号调节激酶和磷脂酰肌醇232激酶的激活,增加胶

原的合成[4]

。

除此之外细胞因子白介素26、白介素21、瘦素等也对HSC 的活化有调节作用。总之,H SC 活化过程是自分泌或旁分泌多种细胞因子协同作用的结果,但这些不同因素可能通过相似的细胞内途径发挥作用。3 肝星状细胞与肝脏疾病

3.1 脂肪性肝炎脂肪性肝病主要表现为肝实质细胞的脂质过度沉积。现有证据表明,肝星状细胞内脂质的量、脂滴类型和其表面脂蛋白受体的改变与H SC 的活化和增殖有关[5]。F raser 等研究表明,酒精性肝损伤在脂肪肝早期阶段,肝组织炎症、坏死不明显或缺乏时HSC 即已激活。

非酒精脂肪肝一般需在脂肪性肝炎的基础上才能发展为肝硬化,即按传统的细胞变性坏死-炎症-纤维增生模式发展,提示非酒精性脂肪性肝炎是非酒精性脂肪肝发生肝硬化的必经阶段。但是研究发现,少数非酒精性脂肪肝患者在无明显肝组织炎症和肝细胞坏死的情况下发生肝纤维化,这可能是脂肪肝对肝细胞损伤本身即是H SC 和EC M 增多的启动因素[6]。3.2 病毒性肝炎病毒性肝炎是由多种不同肝炎病毒引起的一组以肝脏损害为主的传染病,其病理表现为免疫功能紊乱、特异性免疫反应增强、自身免疫反应明显、肝纤维化以及病毒浸润。有报道显示,在慢性乙型肝炎肝纤维化时,由于乙型肝炎病毒的直接作用和其介导的免疫病理导致库普弗细胞的大量浸润,肝细胞碎片激活库普弗细胞使其分泌TGF 2B 1、TGF 2B 1进一步激活H SC 和其他间质细胞导致的大量分泌[7]。

3.3 肝硬化在我国,肝硬化主要由HBV 感染或酒精性肝病所致,最近发现由于肝病引起肠道菌群失调,内毒素吸收增多,可改变星状细胞Toll 样受体4,增强转化生长因子激活星状细胞的活性,有利于肝纤维组织增生。乙型肝炎病毒X 蛋白也可以直接或通过激活细胞因子而激活星状细胞,刺激纤维组织增生[8]。

3.4 肝癌肝细胞肝癌(HCC)发生的过程中常伴有明显的

慢性肝炎与肝硬化,现已知HSC 活化是肝硬化形成的关键。吕丽[9]采用免疫组化方法观察大鼠实验性肝癌组织中活化HSC 数量变化,从而得出肝癌组织中H SC 的数量较正常肝组织明显增多,且随H CC 进展,其数量逐渐增多,实验结果表明,HSC 通过分泌肝细胞生长因子及EC M 等活性物质,促进肿瘤细胞增殖与转移。F acuzi 等[10]在体外实验结果也表明,HCC 细胞上清液可诱导H SC 活化。

4 结论

近年,大量实验及临床研究结果显示,H S C 是肝纤维化发生的一个重要环节,而肝纤维化是所有慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的必经的病理过程。因此对H SC 的治疗是阻止肝脏疾病纤维化进程的核心环节。目前针对HSC 的治疗主要集中于HSC 激活、增殖及胶原合成、促进胶原降解几方面。笔者认为,随着研究不断的深入,针对H SC 来进行肝脏疾病的预防与治疗将会有新的突破。

参考文献

1 Fri edm an ASL ,Art hu r J P .Reversi ng hepati c fi bros i s[J].SciMed ,2002,

8(3):194-205.

2 W ake K.Peri s i nusoi dal stell ate cells(fat 2stori ng cells i n terstiti al cell s ,li 2

pocyt es),t h ei r rel ated s tr u cture i n and around t h e li ver s i nusoi ds ,and vi 2

t a m i n A 2stori ng cells i n extrahepati c oranges [J].In t Rev Cyt o,l 1980,66:303-353.

3 Schnab l B ,Kweon YO ,Frederic k J P ,et a.l Th e rol e of S m ad3i nm ed i at 2

i ng m ouse hepati c st ell ate cell activation[J].H epatology ,2001,34(1):89-100.

4 罗晓勇.肝星状细胞的激活与肝纤维化的研究进展[J].国际外科学杂志,2008,35(2):125-128.

5 陆伦根.肝星状细胞与脂肪性肝病和肝纤维化[J].辽宁医学杂志,

2004,18(2):58-59.

6 孟二红.肝星状细胞在非酒精性脂肪性肝炎患者肝组织中的表达

[J].解放军医学杂志,2003,28(3):271-272.

7 秦勇.细胞因子对肝星状细胞激活调控的研究进展[J].陕西医学杂志,2004,33(11):1038-1039.

8 张定凤.2008年肝脏病学的回顾和展望[J ].中华肝脏病杂志,

2009,7(1):1- 4.

9 吕丽.肝星状细胞、肝细胞生长因子与肝癌相关性研究[J].肝脏,

2005,10(3):213-214.

10 Facuzi S ,L epreux S ,Bed i n D ,et a.l Activation of cu lt u red rat hepati c

stellat e cells by tumoral h epat ocytes [J].Lab Invest ,1999,79(4):485-493.

(收稿日期:2010-01-28)

#医院管理#

新生儿重症监护室院内感染的预防

孙玉玲

作者单位:810000 西宁市,青海省红十字医院N I C U

=关键词> 重症监护室,新生儿;院内感染;预防

=中图分类号> R 722113 =文献标识码> C =文章编号> 1674-3296(2010)06-0125-01 随着围产医学的发展和新生儿重症监护室(N I CU )救治水平的提高,使早产儿特别是极低出生体质量儿的存活率明显提高。但N IC U 集中了早产儿、极低出生体质量儿、危重儿,其免疫功能低下,许多先进的诊治手段和抗生素的应用,使院内感染的机会增加。现就N IC U 医护人员在预防院内感染中存在的问题进行如下分析、探讨。1 存在问题

部分医护人员消毒、隔离意识浅薄,在给患儿检查、处置时,不按要求洗手或进行手消毒,造成交叉感染;接触新生儿的非一次性诊疗器械及物品被污染后,不严格消毒、灭菌,引起交叉感染;忽视了一些小诊疗用品及物体表面的消毒,如公用水龙头、病历夹、门把手、听诊器、婴儿称等,因经常受到病原微生物的污染,成为医院内感染的传播媒介;长期应用抗生素导致新生儿的二重感染。

2 相应措施

2.1 加强院内感染及消毒隔离知识的普及教育进行全院培训,NIC U 工作人员必须无传染性疾病,医护人员严格执行无菌操作及消毒隔离制度。

2.2 严格消毒医护人员入室前应洗手更衣、换鞋、戴口罩、戴帽子。尤以手消毒最为重要,严格执行7步洗手法,洗干净后以一次性消毒纸巾擦干或电烤手器烤干。医护人员接触婴

儿前后均洗手。护理治疗用品最好使用一次性物品。婴儿衣

被、小毛巾、奶瓶等物品专人专用,清洁后高压灭菌。吸引管、湿化瓶应每天更换消毒,使用的暖箱每天清洁消毒,湿化水每天更换,严格执行消毒隔离制度,严格控制探视人员,探视者不能进入监护室,对污染的物品严格按规定处理,杜绝一切感染机会。

2.3 卫生学监测定期对N I CU 层流病房的空气、物体表面、医护人员的手随机进行卫生学监测,并将结果反馈给科室,督促改进消毒灭菌工作。每天用1B 100含氯消毒液擦拭地面、门窗、物体表面、仪器、设备表面,空调过滤网定期清洗。

2.4 合理用药加强抗生素的管理,严格观察用药前后的反应,自觉按规定时间给药,保证患者的血药浓度,以最大限度提高抗生素的使用效果,防止耐药菌的产生。

3 讨论

N IC U 是集中高危新生儿的病情监测和治疗的科室,由于N IC U 患儿病情危重应用监测治疗技术较多,如心电监护、呼吸机、气管插管、动静脉留置、给氧和吸痰等,因患儿自身抵抗力差,长期使用抗生素,其感染的发生率也比其他科室高。加强院内感染知识的普及,强化消毒隔离意识。加强监督指导,每月专职人员下科室进行环境卫生的监测,并将结果反馈给科室,督促改进工作。加强基础护理,预防继发感染,密切观察患者病情变化,能有效预防N I CU 院内感染的发生。

(收稿日期:2010-01-28)

肝星状细胞与肝纤维化(一)

肝星状细胞与肝纤维化(一) 〔关键词〕肝星状细胞；肝纤维化；活化各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化(HF)，其中25％～40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。在过去的几十年里，HF能否发生逆转一直是医学界有争议的问题，现已知HF是一个可逆性的病变，而肝硬化是不可逆的〔1〕。HF是对各种病因所致的慢性肝损伤的一种修复反应，其实质是肝内细胞外基质(ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积。研究证实，肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFLC)，是HF发生、发展的核心环节。各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展〔2〕。在HF的恢复期，有与肝脏瘢痕降解一致的广泛的HSC凋亡〔3〕，因此，诱导活化HSC的凋亡可使HF发生逆转。目前，活化HSC已被看作抗HF治疗的主要靶点。现就HSC与HF的关系作一综述。1HF的发病机制近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝病的发病机制不同，但HF发生的最终共同途径均是HSC，当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。活化的HSC通过旁分泌与自分泌作用合成分泌多种ECM，同时合成、释放大量基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，抑制胶原酶、明胶酶等金属蛋白酶(MMPs)活性，减少ECM降解，导致细胞外基质合成大于降解，最终过量积聚在肝内形成HF。 2HSC活化的机制 2.1HSC的形态学和生物学特征HSC又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙(Disse间隙)内，是目前公认的HF 形成中主要产生ECM的细胞。HSC正常时呈静止状态，形状不规则，胞体呈卵圆形或不规则形，常伸出数个星状突起，胞浆中富含维生素A和甘油三酯的脂滴。除储存维生素A脂滴外，HSC还具有收缩功能，可调节血管功能和肝窦血流；此外，HSC也参加正常肝脏的ECM 改建。当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。HSC的激活可人为地分为两个阶段,即启动阶段及持续活化阶段〔5〕。 2.2启动阶段HSC活化的启动是邻近细胞(如肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞、血小板等)旁分泌作用的结果。肝损伤早期，肝窦内皮细胞(SEC)通过产生变异的纤维连接蛋白(LN)及使无活性的转化生长因子转化为具有促胶原合成活性的活化型，变性坏死的肝细胞通过产生脂质过氧化物，Kupffer细胞通过诱导HSC上血小板源生长因子(PDGF)受体的表达及使无活性的转化为活性型，血小板通过产生PDGF、、表皮生长因子(EGF)等细胞因子均参与启动HCS的活化。另外，ECM的早期改变、脂质过氧化物等也参与活化的启动。其结果是使HSC发生基因表达及表型的改变，表现为转录活化、信号分子活化及诱导早期结构基因表达，使胞膜上表达细胞因子、生长因子受体，如PDGF受体、TGF受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体等，产生对这些介质分子的应答能力，增殖活化为肌成纤维细胞。 2.3持续激活阶段是HSC自分泌及旁分泌共同作用的结果。HSC活化启动后发生一系列表型改变，包括：细胞增生：特别在炎症坏死区域新形成的纤维间隔内，致细胞数量增多；表型转化：由维生素A储存型转化为广谱ECM合成表型，致ECM合成增多；产生收缩性：表达平滑肌肌动蛋白可诱导微循环改变及血小板凝聚；趋化性：向损伤区移行，致损伤区纤维形成细胞增多；细胞因子及其受体表达增强：对化学因子刺激的敏感性增加；表达黏附蛋白受体——整合素家族：整合素是一组二聚体细胞受体，包括胶原、FN受体、纤维连接蛋白(LN)受体，其表达参与介导细胞与基质的相互作用；释放胶原酶及其抑制物：Ⅳ型胶原酶的释放破坏内皮下基质，通过反馈促进HSC转化；而金属蛋白酶抑制物的分泌可减少新生成胶原的降解，最终导致ECM的过度沉积。HSC通过自分泌作用不断刺激自身的

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。

肝星状细胞详解

肝星状细胞肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科简介肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。背景早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。这种观点在当时得到了广泛的认同。直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不

体外正常成人肝细胞分离培养的经验

?经验交流? 体外正常成人肝细胞分离培养的经验Ξ 马巧玉,郝　飞,王宇明,宋志强,刘国栋 (第三军医大学西南医院全军感染病中心,重庆400038) 摘　要:目的　为进一步研究病毒性肝炎免疫发病机制、临床治疗和疫苗研制提供最接近自然状态的理想细胞模型。方法　体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并用1640培养液维持培养1个月以上。结果　分离较多量正常成人肝细胞可在体外存活1个月以上。结论　正常成人肝细胞可在体外被分离培养以供各种肝病基础和临床研究。关键词:正常成人肝细胞;细胞模型中图分类号:R44611文献标识码:B文章编号:167128348(2003)0921228202 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎、原发性肝癌)在我国发病率高,无可靠治疗方法。因此,迫切需要在肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破。近年来,国内外有许多关于用动物肝细胞、胎儿肝细胞及肿瘤细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然状态的成人肝细胞存在较大差别。我们在体外分离培养正常成人肝细胞,以期建立与自然状态最为接近、更适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治等研究的细胞模型。1　材料与方法 111　正常成人肝组织标本,共10例,其中取自意外死亡之3例成年男性(19、24、35岁),1例成年女性(27岁)肝脏;4例成年男性(42、47、55、62岁)胆囊结石或胆囊炎手术时肝脏活检标本;均无肝病史,临床生化和病理检查无异常发现;另有1例成年男性(36岁)肝脏血管瘤标本;2例成年男性(53、58岁)肝癌癌旁组织标本,各种肝炎病毒及AIDS标志物检测均阴性。112　小牛血清　由本校试剂中心提供,用前56℃×30min灭活补体。 113　主要试剂　(1)PRMI21640细胞培养基:购自美国GIB2 CO公司;(2)胶原酶、胰蛋白酶抑制剂:由美国SIGMA公司提供;(3)分散酶:购自德国宝灵曼公司。 114　实验方法 11411　正常成人肝细胞分离　采用体外灌流法分离正常成人肝细胞[1、2]。取上述成年人肝脏2～100g,将肝组织置于培养皿中,用37℃前灌流液自残存血管中反复灌注,至大部分肝脏呈现灰白色,用37℃,0105%的胶原酶(含011分散酶)反复注入残存血管,剪碎肝组织,37℃振荡,消化30min,三层无菌沙布过滤,450r/min×4min离心,弃上清,加入PRMI21640培养液混匀,450r/min×4min离心,弃上清,反复3次,最后用含10%小牛血清1640培养液(完全培养液)按细胞密度1×106ml 稀释后接种至25ml培养瓶和加爬片的24孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱孵育。 11412　正常成人肝细胞培养　24h后换液,弃去含漂浮细胞的培养液,按上述比例,加入PRMI21640培养液,此后每2～3d 更换完全培养液1次,维持培养1个月以上。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存活率。2　结果 211　细胞分离　由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到达部分肝组织,分离效果较差,加入分散酶后可提高分离效率,分离后用台盼蓝染色显示肝细胞存活率约50%～90%。 212　细胞培养　4例胆囊手术后肝组织分离显示肝细胞少,台盼蓝染色显示肝细胞存活率60%,贴壁差(<50%),碎片多,分离培养1周内均放弃;肝血管瘤标本RBC多,肝细胞相对较少,贴壁差,分离后次日放弃;2例肝癌癌旁组织标本分离肝细胞较多,台盼蓝染色肝细胞存活率仅50%,生长差,贴壁少,细胞碎片迅速增多,于分离后3～4d放弃。4例意外死亡捐献的肝组织标本,分离细胞后用台盼蓝染色,肝细胞存活率约90%.24h后约70%～80%细胞贴壁,贴壁细胞前呈圆形,后呈多角形,单核,生长良好,加感染血清组与对照组细胞形态无明显差异。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数台盼蓝染色判断肝细胞存活率,结果见表1。表1 正常成人肝细胞培养的计数、活力鉴定d肝细胞计数肝细胞存活率 10 6.79±0.21×105/ml>90% 20 5.56±0.24×105/ml>60% 30 4.47±0.32×105/ml>60% 3　讨论目前,在肝脏疾病特别是病毒性肝炎的研究中,用动物肝细胞、肿瘤细胞、人胎肝细胞等作为细胞模型最常见,但这些细胞模型与自然感染状态下的成人肝细胞是否有相似的感染方式、途径及生物学特性尚无定论。因此,我们建立了正常成人肝细胞分离培养的细胞模型,以期在最接近自然感染状况的情况下进一步研究肝疾病的发病机制、病理改变、临床治疗及疫苗效果。目前分离肝细胞多采用二步灌流法。因为我们所取用肝组织为非全小叶标本,灌注时,灌注液不能到达部分肝组织,加之用胶原酶分离正常成人肝细胞效率较分离胎肝细胞、动物肝细胞低,手术中取活检肝组织标本小,分离肝细胞少,难以生长,肝血管瘤组织RBC太多,灌注时不易去除;肝癌癌旁组织均有慢性炎症,纤维化明显,分离培养有较大困难,但意外死亡捐献之肝细胞标本较大,献者年轻,肝脏纤维化程度低,均分离 Ξ基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770682)

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防１2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记１6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。（1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多

鼠肝星状细胞分离方法汇总

1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。 [操作步骤] 1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝； 2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉； 3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环； 4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min 灌注3-4分钟； 5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟； 6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液; 7.4℃800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次； 8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。方法二： [动物] 雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。 [操作步骤] 1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔； 2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色； 3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化； 4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤； 5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)； 6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)； 7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。

肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 (2)

第28卷第2期2007年3月武汉大学学报(医学版) Medical Journal of Wuhan Univer sity Vol.28No.2Mar,2007 课题来源:国家自然科学基金资助项目(编号:30371666)作者简介:李婧婷,女,19832,医学硕士生,主要从事肝纤维化机制研究通讯作者:汪晖,女,19632,教授,博士生导师,主要从事生物化学与分子药理学研究肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗李婧婷汪晖廖长秀平洁武汉大学医学院药理学系湖北武汉 430071 摘要肝星状细胞(H SC)激活是肝纤维化发生的中心环节,其激活过程可分为始动阶段(旁分泌刺激和转录调控因素启动级联瀑布式的细胞反应)和持续阶段(旁分泌或自分泌刺激和细胞外基质重建共同维持HSC 活化的表型反应)。肝脏中多种细胞和细胞因子参与调节了HSC 的激活过程。活化型HSC 的表型变化主要包括细胞增殖、收缩和纤维形成等。抗肝纤维化治疗策略主要包括调控HSC 活化增殖或促其凋亡、抑制胶原合成或促其降解、细胞因子治疗和间充质干细胞治疗等。关键词肝纤维化;肝星状细胞;激活;分子机制中图分类号 R657.3+1 文献标识码 A 文章编号 167128852(2007)022******* Molecular Mechanism of Hepatic Stellate Cell Activation and Strategies of Anti 2fibrosis Therapy LI Jingting,WANG Hui,LIAO Zhangxiu,PING Jie D ept.of P ha rma cology ,School of Med icine ,Wuhan Univer sity ,Wuhan 430071,China Abstract The activation of hepatic stellate cell has been considered as the key step of liver fibr osis,mainly classified as initiation phase (paracr ine stimulation and transcriptional events initiating a cascade of cellular r esponses)and per petuation (paracrine and autocrine cytokine activity and ECM r emodeling sustaining the activated phenotype).Multiple cells and cytokines in liver play vital roles in regulating stellate cell activation.Major phenotypic featur es of activated hepatic stellate cell activation include proliferation,contractility,fibrogenesis,matrix degradation,chemotaxis,white blood cell chemoattraction,retinoid loss and cytokine release.Currently anti 2fibrotic therapy str ategies mainly include regulating the activating pr ocess,proliferation and ap 2optosis of hepatic stellate cells,inhibiting collagen synthesis or promoting collagen degradation,gene therapy and infusion of mesenchymal stem cells. Key Words Liver Fibrosis;H epatic Stellate Cells;Activation;Molecular Mechanism 各种刺激因素皆可引起肝细胞的变性和坏死,继而形成肝纤维化甚至肝硬化。细胞外基质(extra 2cellular matrix,ECM)积聚是大多数慢性肝病伴有的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, H SC)是肝内胶原合成最主要的细胞来源。H SC 激活与肝纤维化的发生密切相关。近年来相继提出的一些抗肝纤维化治疗策略都要归功于H SC 激活分子机制的逐渐阐明。

原代细胞培养：原代肝细胞

【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。

IL-1β促肝星状细胞增殖与JNK_AP-1信号转导通路的关系

万方数据

宣墅瘟堂塑墅煎堂盘查兰鱼塑堡！Ｑ旦笙！！鲞箜！旦塑堡垒ｉ璺』璺！！！翌！坚！！竺！丛！巳苎！！！：Ｑ！！兰鲤！！！！！：！墨：塑！：！Ｑ?９０５? ＪＮＫ通路后，ＩＬ－ｌＢ的促Ｈｓｃ增殖作用受到抑制。对照组吸光度为１．５６０±０．１ｌＯ。而经ＳＰ６００１２５预处理的各组细胞，吸光度均减低，ＳＰ６００１２５浓度分别为１０、２０、４０肛ｍｏｌ／Ｌ时，吸光度分别为１．４２７±Ｏ．１１３、Ｏ．７７２ ±０．０９３、０．６７５±０．０７４，与对照组相比其增殖反应均明显降低（Ｐ＜０．０５、０．０ｌ、０．０１），且随ｓＰ６００１２５浓度增加，抑制作用愈加明显，ｓＰ６００１２５浓度分别为１０、２０、４０肛ｍｏｌ／Ｌ时，增殖抑制率分别为８．５２％、５０．５ｌ％、５６．７３％。２．３ＩＬ－ｌＢ激活大鼠ＨＳＣＪＮＫ通路的动力学观察Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ印迹显示，ＩＬ—ｌＢ同时激活ＪＮＫ蛋白的两种同型体，在大约４６ｋＤ及５５ｋＤ位置出现两条杂交带即ｐ—ＪＮＫｌ和ｐ．ＪＮＫ２，在大约４３ｋＤ位置出现内参照Ｂ．ａｃ—ｔｉｎ杂交带。将各杂交带进行灰度分析，结果显示：ＩＬ．１Ｂ可呈时间依赖性激活Ｈｓｃｓ中ＪＮＫ蛋白。未经ＩＬ．１Ｂ刺激的对照组ＪＮＫ活性为０．９８２±Ｏ．２９９；ＩＬ．１Ｂ（１０斗ｇ／Ｌ）刺激ＨＳＣ５ｍｉｎ后，即见ＪＮＫ活化增强（１．５０１±Ｏ．７２０），但无统计学意义；１５ｍｉｎ时明显增强（２．１３３±０．８８２，Ｐ＜Ｏ．０１）；３０ｍｉｎ时达到高峰（３．３６０±Ｏ．４５２，Ｐ＜０．０１），随后有所降低，６０ｍｉｎ时仍保持较高的活化状态（２．１８ｌ±０．７８９，Ｐ＜０．０１），１２０ｍｉｎ后则基本恢复初始水平（１．３８５±０．３６８）（见图１）。图ｌＩＬ－ｌＢ作用大鼠ＨＳＣ时ＪＮＫ活性的时效变化ＦｉｇｌＩＬ－ｌｐａｃｔｉＶａｔｅＪＮＫｉｎａｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎⅡｅｒｉｎｒａｔＨＳＣ２。４ＩＬ－ｌＢ作用大鼠ＨＳＣ后ＡＰ－ｌ活性的时效观察ＥＭＳＡ结果显示，对照组ＨＳＣ内有低水平的ＡＰ—ｌ活化（２４１．８ｌ±５３．０８），ＩＬ—ｌｐ（１０斗ｇ／Ｌ）作用Ｈｓｃｌｈ后，ＡＰ一１与寡核甘酸探针结合的滞后带较前明显增粗、变黑（５８４．６８±６５．０６，Ｐ＜０．０１），２ｈ达到高峰（６４１．３８±５０．９ｌ，Ｊ｝）＜０．０１），４ｈ有所同落但仍明显高于对照组（５５５．６４±４１．３９，尸＜０．０１），而经ＳＰ６００１２５（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）预处理ＨＳＣ３０ｍｉｎ，再加入ＩＬ—ｌＢ（１０¨ｇ／Ｌ）培养２ｈ后，ＡＰ．１活性较ＩＬ一１ｐ２ｈ组明显受到抑制（３２５．４４±３３．７７，Ｐ＜０．０１）（见图２）。３讨论多种损害肝脏因素导致肝损伤后，在肝细胞炎症、环死刺激下，相关细胞分泌多种细胞因子，如转化生长因子（ＴＧＦ）、血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ一１、ＩＬ一６等，这些细胞因子所蕴涵的信图２ＩＬ－ｌｐ促进ＨＳＣＡＰ－ｌ活化及ＳＰ６００１２５抑制ＩＬ?ｌＢ诱导的ＡＰ?ｌ活性ｌ：阴性对照；２：对照组；３：ＩＬ—ｌＢｌｈ；４：ＩＬ－ｌＢ２ｈ；５：ＩＬ?ｌＢ４ｈ；６：ｓＰ６００１２５＋ＩＬ—ｌＢ２ｈ；７：竞争实验Ｆｉｇ２ＩＬ－ｌｐａｃｔｉＶａｔｅｄＡＰ－１ｉｎａｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒａｎｄＳＰ６００１２５ｊｎｈｉｂｉｔｅｄＩＬ－ｌＢ－ｉｎｄｕｃｅｄＡＰ－ｌｂｉｎｄｉｎｇｉｎＩ’ａｔＨｓＣｓ１：ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｍｌ；２：ｃｏｎｔｍｌ；３：ＩＬ－ｌＢ１ｈ；４：ＩＬ—ｌｐ２ｈ；５：ＩＬ－ｌ母４ｈ；６：ＳＰ６００１２５＋ＩＬ—ｌＢ２ｈ；７：ｂｉｏｔｉｎ?ＩａｂｅＩｅｄＡＰ—ｌＤＮＡｐｌｕ８ｕｎｌａｂｅｌｅｄＡＰ一１ＤＮＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）息，需通过ＨＳＣ胞内信号转导系统传递，在某些转录因子的作用下，转导信号入核，从而启动ＤＮＡ复制、转录及翻译表达过程，实现ＨＳＣ活化、增殖、转型并分泌ＥＣＭ，最终导致肝纤维化的发生＂１。ＩＬ．１为一种具有多种生物学功能的强有力的炎性细胞因子，几乎作用于所有体内细胞，调节炎症及多种反应。曾有研究证实，ＩＬ—ｌａ作用于ＨＳＣ，可使细胞分裂增加１６０％。ＩＬ．１ｄ与ＩＬ—ｌＢ的抗原性不同，但生物学活性相似。ＩＬ—ｌｐ是否也具有促Ｈｓｃ增殖作用尚乏报道。本研究结果显示，ＩＬ—ｌＢ作用于ＨＳＣ后，ＨＳＣ增殖反应明显增强。表明ＩＬ一１Ｂ也具有促ＨＳＣ增殖作用，为肝纤维化发生的重要致病因子。ＭＡＰＫ是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、分裂、增殖等多种过程。在哺乳动物细胞中已成功克隆了ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ５四个ＭＡＰＫ亚族。这些ＭＡＰＫ亚族能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要作用”芦’。Ｋｉｄａ等¨１发现，ＩＬ．１可通过ＪＮＫ通路上调齿龈成纤维细胞表达基质金属蛋白酶一ｌ（ＭＭＰｌ）及前列腺素Ｅ２。而ＩＬ一１Ｂ促Ｈｓｃ增殖及肝纤维化发牛的信号转导通路是否有ＪＮＫ的参与鲜有报道。本研究显示，ＩＬ—ｌＢ可在短时间内激活ＪＮＫ通路，刺激５ｍｉｎ后，ＪＮＫ开始活化，３０ｍｉｎ时达到高峰，随后逐渐降低，２ｈ后基本恢复初始水平。表明ＩＬ—ｌＢ可通过激活ＪＮＫ发挥生物学作用。ＡＰ—ｌ作为转录调节蛋白，将细胞外刺激信号传导至细胞核，激活ＡＰ—ｌ位点的靶基因转录。ＡＰ一１为Ｊｕｎ家族成员（ｃ．ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ）组成的同源二聚体，或Ｊｕｎ家族与Ｆｏｓ家族（ｃ．ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、△ＦｏｓＢ、Ｆｒａｌ、Ｆｒａ２）组成的异源二聚体。许多基冈（如ＴＧＦ．Ｂ、纤维连接蛋白、层连蛋白、ＴＩＭＰ）的启动子中均存在与ＡＰ—ｌ结合的ＤＮＡ序列。ＡＰ．１与之结合即可调节该基因的转录。因此ＡＰ．１活化在细胞增殖、转化及ＥＣＭ合成中万方数据

干细胞培养

造血干细胞的特性与应用姓名：学号： xx大学生命科学学院，2010生物科学摘要：关键词：造血干细胞；生物学特性；应用 1造血干细胞的来源胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM）区。而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM区，目前尚无定论。 2造血干细胞的特性与鉴定 2.1造血干细胞的生物学特性 2.1.1造血干细胞的活化 1986年Lemischka等通过对移植小鼠血液细胞DNA分析所做的克隆研究发现，在小鼠接受移植后的造血恢复期，植入的造血干细胞不是被平均使用，一部分克隆逐渐消退;以移植小鼠的骨髓做二次移植后，二次移植的小鼠造血由在

一次移植中与造血无关的另一部分克隆来维持。结果提示，造血干细胞并非全部处于增殖分化周期中。一般情况下，大部分造血干细胞处于静止期，在必要时才进入细胞周期进行细胞分裂。造血干细胞分裂后，其子代细胞一个通过自我复制维持造血干细胞的特性，另一个则通过分化成为多能性造血祖细胞。造血干细胞的活化机制尚不明确，但至少其中一个机制是通过各种细胞因子来调节。人们推测，造血干细胞的活化，需要多种刺激因子的协同作用。在细胞刺激因子之外，细胞抑制因子也能调节造血干细胞的活化。 2.1.2造血干细胞的自我更新造血干细胞最为基本的生物学特征是其具有高度的自我更新能力(Self-re-newal)，即它能通过自我复制方式使子代细胞与亲代细胞具有完全相同的特征。造血干细胞的这种高度的自我更新能力，在维持机体一生的造血过程中具有重要意义。因为，造血干细胞如果不能通过自我复制进行自我更新，随细胞的增殖分化成熟，干细胞池即会被耗尽而导致难以维持造血。大量研究证实，造血干细胞经分裂后其子代细胞基本上能够保持与亲代细胞完全相同的特性。但也有学者认为，即使是造血干细胞，只要行分裂，从严格的意义上来讲，就不存在完全的自我复制，而已进入了分化阶段。造血干细胞是否确实能够进行完全的自我复制，尚存争议。但具有长期体内外造血重建能力这一特征是造血干细胞所必备的。 2.1.3造血干细胞的多向分化通过放射线照射，诱导细胞产生染色体异常，然后将具有这种染色体异常的造血干细胞移植给小鼠，在小鼠体内可以看到含淋巴细胞在内的所有血液细胞均具有相同的染色体异常，说明造血干细胞可以形成含淋巴细胞在内的各种血液细胞。现已明确，造血干细胞向成熟细胞分化过程中受到多种正负造血因子的作用，形成一种较为复杂的调控网络。在综合因素作用下，造血干细胞可以分化形成红系、髓系、巨核系成熟血液细胞，也是淋巴系干细胞的来源。除造血系细胞外，近年还发现造血干细胞可以分化形成一些非造血细胞，如破骨细胞、表皮生发层细胞等。新近在一例作异性间骨髓移植后的病人，发现受者肝细胞具有供者的染色体核型，提示其来源于供者的造血干细胞。而近

小鼠原代肝细胞培养

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。

小鼠肝星状细胞分离

分离前准备：分离前晚小鼠禁食不禁水前灌流液NaCl 8g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06 g, NaHCO3 g，NaHCO3 0.35 g,加超纯水至终体积l L 酶配制液Nacl 8 g, Kcl 0.4 g, CaCl2 0.56 g, Na2HPO4·12H2O 0.151 g, NaH2PO4·2H2O 0.078g, HePes 2.38g, NaHCO3 0.35g, 溶解到1L 超纯水中含钙GBSS液：KCl 0.37 g，CaCl2 0.225l g，MgCl2·6H20 0.21 g，MgS04 0.0342g，KH2P04 0.03g，NaHC03 2.27g，NaH2P04 0.1196g，葡萄糖1.0 g，加超纯水至终体积1L 链酶蛋白酶E灌注液：130 mg, 酶配制液100 ml 胶原酶灌注液：Ⅳ胶原酶30 mg，酶配制液100ml 震荡消化液：Ⅳ胶原酶12mg, 链酶蛋白酶E 5mg，Dnase 5mg，酶配制液50ml 28.7% Nycodenz分离液：Nycodenz粉末28.7g，含钙GBSS 100ml 以上液体0.22um 过滤除菌，置于37度水浴预热分离： 10% 水合氯醛0.5ml麻醉小鼠，固定，75%酒精消毒，开腹，暴露肝门静脉，游离门静脉，埋线，24G 留置针进针，固定，打开蠕动泵，15ml/min灌注，剪开下腔静脉。流出液体澄清后，换链酶蛋白酶E灌注液，10ml/min,20min后换胶原酶灌注液，灌注30min，剪下肝脏，撕碎置于震荡消化液，加入1ml双抗，37度恒温摇床150rpm 30min。200目过滤。4度预冷DMEM中和。4度750g 7min离心，弃上清，重复一次。4度50g 3min,弃沉淀，4度750g 7min离心，弃上清，重悬，加Nycodenz调整密度1.04-1.055g/ml 之间，上铺1ml无钙GBSS，20度1350g 15min，吸取白色细胞层，10%DMEM 重悬，4度750g 5min，弃上清，20%FBS DMEM培养，24小时换液。

肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌

注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。BT01-100 蠕动泵( 保定格