低温生物医学技术-第三讲

低温生物医学技术 第三讲
低温生物医学基本原理之二-----玻璃化理论及其应用
3.1关于“两步法”低温保存机理的探讨
冻结以前:
慢速冷却过程:
（细胞小、膜渗透率高、降温慢）
胞外溶液
不等渗 等渗
胞内溶液
胞外出现冰（胞外冰）； 胞外溶液浓度增加； 胞内水分及时向外渗透; 细胞激烈收缩； 胞内不出现冰（无胞内冰）。
3.6 反玻璃化问题
• 成功的玻璃化冻结降温只是成功了一半！ 除了在降温冷却过程中避免结晶固化，还应在复 温加热过程中避免反玻璃化。
Mackenzie（1970）将酵母细胞快速冷冻至-196℃， 然后分批慢速复温至不同温度，再快速复温，分别 测定细胞存活率。 Bank(1970)将酵母细胞快速冷冻至-196℃，然后 分批慢速复温至不同温度，再快速冷冻至-100℃ ， 分别进行低温电镜观察再结晶情况。
当水溶液或生物样品被冷却至其初始 冻结温度后，就不断有冰晶形成和生长。 由于冰晶中成分几乎全是纯水，从而提高 了未冻基质（unfrozen matrix,UFM）浓度， 这种浓度的升高会严重影响生物样品中细 胞进行低温冻存时的存活率。
u 在固液两相平衡时未冻 水的质量 冻结前溶液中水的质量
获得未冻水的方法
冻结以前:
胞外溶液
等渗
快速冷却过程:
（细胞大、膜渗透率低、降温快）
胞内溶液
胞外出现冰（胞外冰）； 胞外溶液浓度增加； 胞内水分来不及向外渗透; 胞内溶液过冷; 胞内出现冰（胞内冰）。
细胞低温损伤的两因素假说
胞内冰损伤 溶液损伤
存 活 率 总效果
冷却速率 (Mazur,1972)
有比较完美的保存方案吗？
3.4.1 部分玻璃化
慢冻过程
快冻过程
这种部分结晶的玻璃化是冻结法低温保存中细胞能否存活的关键因素.
最佳冷却速率与玻璃化
从玻璃化的角度 来看，冻结法低温保 存就是在最佳冷却速 率条件下，通过细胞 外的冻结使细胞内溶 液达到玻璃化程度。 这种胞外结晶，胞内 玻璃化，正是“二步 冻结法”的基本思想。
璃化转变温度；Td反玻璃化转变温度
完全玻璃态是生物材料玻璃化低温保存所应达到的理想状态，这样可以完 全避免结晶带来的各种损伤。
3.5 玻璃化溶液
• 生物系统及其低温保护剂溶液实现完全玻 璃化转变主要有两种途径： • （1）低浓度保护剂系统的超快速冷却—— 适用于表面积与体积之比很大的生物材料， 如细胞； • （2）较高浓度保护剂系统的慢速降温—— 适用于表面积与体积之比较小的生物材料， 如器官等，但需要开发合适的“玻璃化溶 液”，为什么？（传热热阻太大！）
HOW
• 80年代，Mazur提出：造成过慢冷却过程中 细胞损伤的主要机理并不是溶液中盐浓度 过高，而是溶液中未冻水份额过低所致。 但Pegg不认同此观点，至今未统一。 • 华泽钊（1987年）等用低温显微系统观察 三元溶液DMSO-NaCl-水体系中白细胞存活 率，证实了Mazur的假说。
R
3.3.2 玻璃化转变既与热力学有关， 又与动力学有关
只要冷却速率足够快，温度足够低，几乎所有材料都 能从液体过冷到玻璃态固体。 • “足够低”的意思是必须保证T<Tg； • “足够快”的意思是冷却过程在穿过Tg<T<Tm温区 的时间必须如此之短（如纯水10^7℃/s），以至于 不发生晶化，或冷却速率快于成核速率和生长速率。 • 动力学特征：玻璃化转变过程中，非晶态的形成取 决于冷却速率（热力学），同时，其玻璃化转变温 度本身也将随着冷却速率的改变而变化（动力学） （难道与测量仪器的热事件滞后没有关系吗？ ）。
3.5.2 混合使用也可使保护剂的毒 性得到抵消或中和
实验表明，甘油和乙二醇的毒性较 小，但Cv都较大，玻璃形成能力差。 而1，2丙二醇玻璃形成能力较大， 但浓度高于10%时，毒性很大。当把 它添加到前两者时，可以使其Cv降 低，但玻璃形成能力增强，同时毒 性很小。
因而，如今的低温 保护剂均是以混合 保护液体系为主！
• 对于生物样品中未冻水份额一般采用估算 方法（利用稀溶液冰点降低性质）； • 也有采用一般扫描DSC方法测定（存在热事 件滞后）； • 华泽钊采用低温显微图象分析法（与图像 识别精度有关）； • 胥义采用分布扫描DSC方法测定。
结论：快速冷却过程中产生的胞内冰本身对细胞并非致命的损伤，但若在 复温过程中速率过慢，使胞内冰再结晶，则对细胞的损伤是致命的；如果 采取快速复温仍可能使细胞有教高存活率。复温速率越快越好吗？
有关反玻璃化动力学理论查看相应 的参考文献！如有兴趣，我们可以 再补充！
The end
2.7 冻结过程中的未冻水份额
冻结以前:
胞外溶液
等渗
玻璃化转变过程:
胞内溶液
胞外出现少量冰； 胞外溶液浓度略微增加； 不至于胞内水分向外渗透; 胞内溶液过冷,但胞内不出现冰。
WHAT
“两步法”是指将臵有细胞的含抗冻剂 的盐水溶液，第一步是先慢速冷却至 中间的某一温度；第二步是将其直接 臵入液氮。
WHY
• 第一步慢速降温，细胞周围形成高浓度溶 液，只要未冻水份额不很低，在短时间内 不会造成明显的损伤； • 第二步直接投入液氮环境，容易形成非晶 态，而不会造成或减少细胞损伤。
不同态物质中质点相互作用示意图 （a）气体；（b）液体；（c）晶体
3.3.1 液体可以通过两种方式而固化
1、当降温速率比较低时， 在凝固点（熔点）Tm处，液 体向晶体的转变，可表现为 晶体固态的体积突然收缩 （本人曾经在研究兔血管材 料时，是先膨胀后减小 的？？）； 2、当降温速率足够快时， 液体在Tm处并不发生相变， 液相一直保持到Tg时发生玻 璃化转变，并不存在体积突 变，而是体积曲线斜率减小。
• 一般来讲，玻璃化溶液的浓度都比较高， 在常温常压下仍会对生物系统产生毒性。 如何解决？ • 降低玻璃化溶液初始浓度，但又很难实现 玻璃化转变！怎么办？
3.5.1 高压可以降低保护剂的使用 浓度
Fahy,1984
高压下，冰晶很难形成，降低了Th和Tm；但分子之 间更加接近，使溶液黏度增加，从而提高Tg。使得 保护剂初始浓度可以比较低。 实验表明，添加低温保护剂后，高压并不会带来生 物组织的损伤，而且，一旦利用高压实现玻璃化后， 无须在高压下保存，只须在复温时保证高压即可。
Baidu Nhomakorabea
溶液中DMSO的质量分数 溶液中NaCl的质量分数
当u低于0.13时， 不论盐浓度是多 少，白细胞存活 率一般不超过30%； 当u由0.13增高到 0.2时，存活率急 剧增高到80%以上。
3.2 玻璃化保存方法的发展
• Luyet(1937)最早提出对生物体快速冷却,冰晶有可能来 不及形成,就可以实现玻璃化保存。事实上，当时这种 方法在对生物体进行低温保存的研究结果都是否定的 （事实上都没有实现真正的玻璃化）。因此，此后一段 时间的研究暂停！ • Polge(1949)一次偶然发现，添加了甘油的家畜精子可 以在低温下存活。 • 此后的20-30年间，大部分研究重点在低温保护剂对冰 晶形成的影响，曾经几次观察到，如果低温保护剂浓度 足够高，也可能在低冷却速率下也可实现完全的玻璃化， 但遗憾的是：当时没有人进一步应用这一观察去试图实 现生物体的玻璃化保存。 • 直到80年代左右，James，Ham(1981)的研究证实：采用 低温保护剂后，快速冷却能够大大提高生物体的存活率。
3.4.2 完全玻璃化
一区：如果冷却速率不够快，一般不能实 现玻璃化转变。 二区（Tg≤Th）：一般热分析技术已观察 不到匀相成核的结晶放热，可以通过急冷 技术使小样品冷却到Tg以下而实现玻璃化。 但是，不可避免存在大量还未来得及生长 三区(Tg≥Th)：在这一温度区，冷却过程 的晶核，如果慢速复温，或在Tg附近保温 中不发生任何冻结，因此能够使体积较大 退火，则晶核可能长大，使玻璃态变成晶 的样品在慢速冷却的条件下实现完全玻璃 态，而发生反玻璃化转变。 化。Tg和Th线交点处的低温保护剂浓度是 实现完全玻璃化的最低浓度。但可能发生 四区(反玻璃化消失)：没有成核的可能， 反玻璃化，如何避免？（快速加热） 系统完全稳定，但是存在一个主要问题 （浓度太高，毒性太强，不实用。） Tm熔融温度；Th匀相成核温度；Tg玻
冷却速 率越快，玻 璃化转变温 度也越高。
3.3.3 水和水溶液的非平衡性质
当温度降到0℃以下时，冰是水的稳定相， 而那些未冻系统，无论是液态还是固态，过冷 还是过饱和，都处于亚稳态。亚稳态一般是由 浓度很高的水溶液或通过快速冷却到极低温的 非平衡过程而形成，如玻璃态。此过程可以通 过DTA或DSC观察到。
Fahy(1981)首先明确提出：采用高浓度的低温保护剂， 可在较慢的冷却速率下实现生物体完全的玻璃化，并 于1985在Nature上首次报道鼠胚胎的玻璃化保存获得 成功。这是玻璃化保存技术走向实用化的真正突破。
3.3 玻璃化转变的概念
自然界中，固体有两种形式：晶体和玻璃体。具有确定 的体积和形状，并对改变体积和形状有阻力，两者根本区别 在于内部的微观结构是否有序排列。 1、玻璃态物质的X射线衍射 曲线与液态曲线相似，二者 同属“近程有序，远程无序” 的结构； 2、但玻璃态固体不会象液体 那样流动，而象晶体那样能 够保持自己的形态。
1、浓度较低时，只有 结晶； 2、浓度较高时，出现 部分玻璃化；（高才的 研究） 3、浓度很高时，出现 完全玻璃化。
3.4 玻璃化低温保存的若干问题
对于低温生物医学来说，人们最感兴 趣的是有关玻璃化转变。而各种低温保护 剂溶液样品在不同的冷却条件以及不同的 初始浓度下，最终得到两种不同的玻璃化 结果：部分玻璃化和完全玻璃化。