小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的实验观察

中国真菌学杂志 2010 年 12月 第 5卷 第 6 期
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Ch in J M yco,l D ecem ber 2010 , V ol 5, N o . 6
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马尔尼菲青霉 ( P en icillium m arneff ei ) 是一 种双相型致病真菌 , 37∀ 培养或在组织体内时呈酵 母相 , 25∀ 室温培养时为菌丝相 , 感染人体可引起 高致死率的马尔尼菲青霉病。该病目前被认为是 东南亚地区的流行病, 常发生于免疫受损的人群 , 尤其是人类免疫 缺陷病毒感染者 。目前马尔 尼菲青霉与人类感染发病的关系仍不十分明了, 推 测人类通过吸入空气中的马尔尼菲青霉分生孢子 [ 3] 而致病, 并经血行播散至全身脏器 。目前尚未明 确马尔尼菲青霉酵母相细胞如何逃避巨噬细胞的 清除。本文利用小鼠腹腔巨噬细胞与马尔尼菲青 霉酵母相细胞进行体内和体外共培养, 通过马尔尼 菲青霉酵母细胞菌落形成单位 ( co lo ny for m ing u n i, t CFU )数的变化, 观察巨噬细胞对酵母相细胞的 影响。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料 实验动物 6~ 8 周 BALB / c 小鼠由中山大学 医学院动物中心提供, 体重 20~ 25 g , 雌性。 菌株来源 马尔尼菲青霉 SUM S0152 株, 由中 山大学附属二院医学真菌研究中心提供, 分离自 1 名血液病患儿的血液标本, 经形态学和 DNA 测序 鉴定。 主要试剂和仪器 脑心浸汁培养基, 沙氏培养 基, 无菌磷酸缓冲液 ( 1 # PBS ), 钙荧光白 ( S igm a 公司 ) , DMEM 细胞培养基和细胞培养瓶 ( G ibco 公 司 ), CO2培养箱 ( H eraeus BB16 , 德国 ) , 倒置光学 显微镜 ( O lym pus CX 40 , 日本 ), 倒置荧光显微镜 ( O lym pus , 日本 ) , 超净工作台 ( 苏净 BH C 1300∃ A /B3 , 苏州安泰空气技术有限公司 ) 。 1 . 2 实验方法 酵母相菌液制备 将在脑心浸汁培养基平皿 上转种好的酵母相菌落接种于脑心浸汁液体培养 基中 , 37∀ 150 r /m in 振荡培养 72 h , 镜下观察有纯 化酵母细胞出现, 离心收集。将收集到的酵母细胞 用灭菌双蒸水洗涤 3 次 , 去除培养液, 使用 1 # PBS 6 调整菌液浓度为 1 . 5 # 10 /mL, 4∀ 保存备用。 小鼠巨噬细胞的制备 取 20~ 25 g 健康雌性 BALB / c 小鼠 3 只, 颈椎脱臼处死, 消毒小鼠腹部皮 肤, 持镊提起腹中部皮肤并剪开, 暴露腹膜 , 避开血 管分别腹腔注射无菌 1 # PBS 5 mL, 反复轻揉腹壁 5 m in后 , 无菌注射器分别取腹腔液 3~ 4 mL, 2 000
Phagocytosis of Pen ic illium marneffe i in yeast phase by m acrophages of m ice
FENG P e i y ing1, 2 , HUANG H ua i q iu2, ZHANG Jing1, 2, ZHANG X iao hu 2 i , SUN Jiu feng1, X IE Zhi1, LU Sha1, LU Chang m ing1, X I L i yan1 (1 . D ep artm en t of D er m atology and V enereo logy, the S econd Aff iliated H osp ital of Sun Yat sen Un ivers ity, Guangzhou 510120, Ch ina; 2. D ep artm en t of D erm ato logy and V ener eology, the T hird A ff iliated H osp ital of Sun Yat sen U niver sity, Guangzhou 510630, Ch ina ) Ab strac t ! O be jective T o study the effect of per itoneal m acrophag es of BALB / c m ice on phagocytos is ofP enicillium marneff ei
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mL 于无菌离心试管内 , 37 ∀ 、 5% CO2恒温培养箱 中贴附 30 m in , 用无 菌 1 # PBS 冲洗 未被吞 噬的 酵母细胞 , 再用冰冷 的无菌三蒸水 使巨噬细胞细 胞膜破裂 , 释放出巨噬细胞内的酵母细胞 , 取菌悬 液进行菌落计数。 CFU 的测定 取 50 L 菌悬液采用梯度稀释 法, 在沙氏培养平皿上 25∀ 培养 48 h , 计菌落数 , 并以稀释倍数校正。 钙荧光白染色
in yeast phase . M ethod s Y east phaseP. m arneffei and per itonea lm acrophages o f BALB /c m ice w ere cu ltured bo th in v itro and in vivo . T he num ber o f co lony for m ing unit ( CFU ) w as counted at 60 m in, 120 m in, 240 m in and 360 m in respectively . T he d iffe rence of the CFU numbers betw een the in v itro and in vivo groupsw as then ana ly zed . Calcofluor w hite sta in w as applied to observe the m or pho logy of yeast ce lls . Resu lts CFU numbers in fou r ti m e po ints in each g roup d iffe red s ignificantly ( P < 0. 05), w hile the d iffer ence of CFU num bers betw een the in vitro and in vivo groups sho w ed no sign ificance ( P > 0. 05 ). P. marneff ei in y east phase sho w ed light blue by ca lco fluo r wh ite sta in under fluo rescence m icroscope . Conclusions N o obv ious destroy or lysis ex ists in P. m arneffei when co cultured w ith m acrophages . Ca lco fluo r w hite sta in is pre ferred for iden tification of m acrophage and yeast ce lls . K ey words! m acrophage ; P en icillium m arneff ei; co lony for m ing un it ; ca lco fluo r wh ite sta in [ Ch in JM yco,l 2010 , 5( 6): 332 335]
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将马尔
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尼菲青霉酵母相细胞按每瓶 1 mL ( 1 . 5 # 10 /mL ) 接种于上述含 6. 0 # 10 /mL 巨噬细胞的培养瓶中, 每个时间点培养 3 份, 放入 37∀ 、 5 % CO2恒温培养 箱, 分别作用 60 m in、 120 m in 、 240 m in 、 360 m in 取 出, 用无菌 1 # PBS 冲洗培养瓶 , 去除巨噬细胞 外 的酵母相细胞 , 用冰冷的无菌三蒸水使巨噬细胞细 胞膜破裂 , 释放出巨噬细胞内的酵母相细胞 , 取菌 悬液进行菌落计数。 酵母相细 胞与巨 噬细胞 体内共 培养
[ 1, 2]
r/m in 离心 10 m in, 弃 上清, 加入 DMEM 培 养液调 整细胞浓度 至 6 . 0 # 10 /m L, 细 胞悬液 置入培 养
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瓶, 37∀ 培 养、 5 % CO2 恒温培养 箱 2 h 后 , 吸弃 上 清, 用预 热 培 养液 洗 2 次 , 留 下 贴 壁 细胞 , 加 入 DMEM 培养液孵育细胞。 酵母相细胞与巨噬细胞体外共培养
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中国真菌学杂志 2010年 12月 第 5卷 第 6 期
Ch in J M yco,l D ecem ber 2010 , V ol 5, N o . 6
论著
小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的 实验观察
冯佩英
1 , 2
黄怀球
2
张静
1, 2
张晓辉
2
孙九峰
1
谢治
1
鲁莎
1
鲁长明
1
席丽艳
1
(1 . 中山大学附属第二医院皮肤科 , 广州 510120 ; 2. 中山大学附属第三医院皮肤科, 广州 510630)
6
取 12
只小鼠腹腔注射 1 m L ( 1 . 5 # 10 /mL ) 马尔尼菲 青霉酵母相细胞悬液 , 随机各取 3 只分别 60 m in、 120 m in、 240 m in 、 360 m in 后颈椎处死小鼠 , 无菌 注射 5 mL 无菌 1 # PBS 到腹腔中 , 揉匀 5 m in 后 取腹腔液 , 调细胞浓度为 6 . 0 # 10 /mL, 分别取 1
基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30770121 ). 作者简介 : 冯佩英, 女 ( 汉族 ), 博士 , 主治医师 . E m ai: l fengpeiying@ m edm ai.l com. cn 通讯作者 : 席丽艳, E ma i:l xi liyan @ m ed m ai. l com. cn
摘要 !
目的
探讨小鼠腹腔巨噬细胞对马尔尼菲青霉酵母相 细胞的影 响 , 为 研究抗 马尔尼 菲青霉 的免疫 机制提供 一定 将马尔尼菲青 霉酵母 相细 胞与 小鼠腹 腔巨 噬细胞 在体 内和 体外 两种 方式 下进 行共 培养 , 分别 于 60 经体内和体外两
的实验依据。 方法
m in、 120 m in、 240 m in 和 360 m in 后进行菌落形成单位 ( CFU ) 计数 , 统计分析体内组与 体外组 CFU 数 结果的差 异性。利用 钙荧光白染色巨噬细胞胞内的马尔尼菲青霉酵母相细胞 , 荧光显微镜下观察细胞形态特征的变化。 结果 镜下可见巨噬细胞内的酵母细胞被钙荧光白染上淡蓝色荧光。 结论 是一种良好的检测真菌方法。 关键词 ! 巨噬细胞 ; 马尔尼菲青霉 ; 菌落形成单位 ; 钙荧光白染色 R 379. 9 文献标识码 ! A 文章编号 ! 1673 3827( 2010) 06 0332 04 中图分类号 ! 种方式共培养 , 两组之间的 CFU 计数差异无统计学意义 , 但两组内不 同时间点的 CFU 计数差异存在统计学意义。荧光显微 小鼠腹腔 巨噬细胞在体内、 外对马尔尼菲青霉酵母相 细胞不起明显的杀灭或溶解作用 , 其最大的吞噬时间为共培养 240 m in。钙荧光 白染色可快速有效的区分巨噬细胞与真菌 ,
[ 4]
( ca lcof luo rw hite sta in )
3
为观
察巨噬细胞胞内的马尔尼菲青霉酵母相细胞形态 特征的变化, 取 10 L 稀释 1 # 10 的菌悬液涂片 , 95 % 甲醛固定 10 m in , 无菌 1 # PBS 冲洗 2 次 , 0 . 1 % 钙荧光白染色 10 m in , 无菌 1 # PBS 冲洗 2 次后 荧光显微镜下观察酵母细胞形态。 1 . 3 统计方法 体内组与体外组 CFU 数据以 x % s 表示 , 组间 比较用两独立样本的 t 检验 , 组内比较使用多组定 量资料的 KruskalW allis秩和检验。 2 结 果