线粒体功能
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线粒体功能及其检测
线粒体结构
线粒体是真核细胞的一种细胞器，包括四个功能 区隔 :外膜、内膜、膜间隙和基质。
主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占 65-70%，脂类占25-30%。
外膜 (out membrane)
膜孔蛋白（porin）、离子通道蛋白以及Bcl-2 家 族蛋白。
由膜孔蛋白构成的亲水通道，允许分子量为5KD 以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。
STZ rats, 观察时间：4，8周
肾组织:
8-羟基脱氧鸟嘌呤 (8-OHdG，kidney and urine) Mitochondrial DNA Deletion COX I/COX IV(mt DNA/nDNA)
Maiko Kakimoto, Toyoshi Inoguchi, Toshiyo Sonta. Accumulation of 8-Hydroxy2’-Deoxyguanosine and Mitochondrial DNA Deletion in Kidney of Diabetic Rats. Diabetes 51:1588–1595, 2002
糖尿病肾病
glucose-induced ROS initiates mesangial cells apoptosis glucose-induced ROS initiates podocyte apoptosis and depletion glucose-induced ROS initiates endothelial cell apoptosis glucose-induced ROS initiates tubular cells apoptosis
doxorubicin nephrosis rats
肾组织：
NADH dehydrogenase(complex I) cytochrome-c oxidase (complex IV) COX I mtDNA levels mtDNA deletion
Dirk Lebrecht1, Bernhard Setzer1, Rolf Rohrbach, et al. Mitochondrial DNA and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis. Nephrol Dial Transplant, 2004, 19: 329–336
内膜 （inner membrane）
电子传递链(呼吸链)复合物I~IV 和复合物V(ATP 合成酶)。
通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过， 大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。
膜间隙(intermembrane space)
细胞色素C 电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ADP/ATP转 换蛋白。 线粒体膜转运孔道(mitochondrial permeable transition pore，MPTP)存在于内外膜接触点。 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)和 Procaspase 2、3、9 及其他酶蛋白。
氧化应激
8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG，ELISA法) ROS(分光光度法) glutathione and coenzyme Q(分光光度法, HPLC)
凋 亡
细胞色素C含量（western blot) caspase-9 and caspase-3 (分光光度法) BCL-2(免疫组化，western blot) BAX (免疫组化，western blot) 膜转运通道开放程度(分光光度法) Ca++(分光光度法) 膜电位
High glucose－mitochondrial ROS－kidney cells apoptosis
7 cases, clinical diabetes was 5.6±0.6 years 胰岛组织:
Nitrotyrosine level(硝基酪氨酸, marker of oxidative stress) complex I and complex V ATP/ADP ratio Uncoupling protein-2 (UCP-2) expression membrane potential
线粒体功能
能量供应 氧化应激 凋亡 钙储池 细胞周期、信号转导 肿瘤 发育等
线粒体与能量供应
细胞有氧呼吸和供能的场所，供应细胞生命活 动95%的能量。
线粒体的主要功能是把氧化各种底物产生的自 由能转化为可被细胞直接利用的形式－ATP。 线粒体具有能量代谢与自由基代谢两条途径。
M. Anello et al. Functional and morphological alterations of mitochondria in pancreatic beta cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia, (2005) 48: 282–289
mtDNA突变 呼吸链复合体I～IV活性下降 ATP合成减少 氧自由基产生增多 钙稳态失衡 脂质氧化增强
线粒体病理性损伤
II型糖尿病
胰岛β细胞线粒体参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗的 形成。 线粒体是高血糖时细胞ROS的重要来源。 线粒体氧自由基增多与糖尿病微血管并发症的发病 机制相关。 线粒体本身受氧化应激攻击，导致mtDNA 合成减 少、发生突变。
这些都是启动细胞凋亡的因素。
线粒体与凋亡
从线粒体释放的细胞色素C与凋亡诱导因子、 Procaspase 9结合在一起形成“凋亡体” （Apoptosome），导致Caspase 9和Caspase 3的激 活。 内膜Bcl-2 家族蛋白调控紊乱。 Caspases激活、胞浆Ca++水平升高、产生神经酰胺， 直接或间接地引发膜转运孔道持续开放。
线粒体功能检测
能量供应
enzyme activity assays(分光光度法)
NADH (complex I), succinate dehydrogenase (complex II) 细胞色素c还原酶 (complex III) COX (complex IV)
ATP （ luciferin/luciferase发光法，核磁 共振法） 呼吸控制率(ATP 合成功能，氧电极法)
线粒体功能紊乱
线粒体病（primary genetic defects）
线粒体病理性损伤
线粒体病
mtDNA突变(点突变、缺失、插入）导致线粒体功 能缺陷。如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病、 老年性痴呆、帕金森病、糖尿病等。 mtDNA突变随着年龄累积。
线粒体功能变化
线粒体DNA
线粒体基因组
哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子，几乎 每一对核苷酸都参与一个基因的组成。
线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋 白质。 仅有少数线粒体蛋白质是由mtDNA编码，大多 数线粒体蛋白质（90%）还是由核DNA编码。
mtDNA
环状，编码2 种rRNA、22 种tRNA和13 种参与呼 吸链形成的多肽。 通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完 善的自我修复系统，又靠近内膜呼吸链，极易受 环境影响，突变频率比nDNA 高10~20 倍。 如果线粒体DNA发生突变，不能产生足够ATP 而导致细胞功能减退甚至死亡，临床上表现复杂 多样，即线粒体病。 母系遗传。
①燃料分 解（胞质 中）
葡萄糖
②乙酰 CoA生成
③三羧酸循 环(线粒体基 质)
脂肪酸
氨基酸
④电子传递和 氧化磷酸化(内 膜上)
生成ATP
线wk.baidu.com体与氧化应激
线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位，消 耗氧用于合成ATP的同时不可避免地产生活性氧。
氧化应激作用下，膜转运孔道开放造成线粒体基 质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼 吸链脱偶联，能量产生中断。 还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜 破裂，通透性增高，释放出包括细胞色素C在内 的各种活性蛋白。
mtDNA
levels of mtDNA(PCR) mtDNA deletion(PCR) COX I/COX IV(PCR，免疫组化， western blot)
Thank you
过多自由基的产生可导致mtDNA的损伤，氧化损 伤是mtDNA突变的主要原因。
线粒体本身也极易受氧化应激的攻击。
活性氧在启动和调节细胞凋亡的过程中扮演着重 要的角色。
活性氧的积累可以导致：
线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生；
细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质中； BAX表达，caspase活化等。
体外培养肾小管上皮细胞
ATP 膜转运通道开放程度 cytochrome c caspase 3 Ca++
Peraza MA, et al.Morphological and functional alterations in human proximal tubular cell line induced by low level inorganic arsenic: evidence for targeting of mitochondria and initiated apoptosis. J Appl Toxicol. 2006, 26(4):356-67
ROS－膜转运孔道持续开放－凋亡
钙储池
线粒体感受到钙微区，通过膜上协同转运体将钙 摄入基质，然后以磷酸钙的形式储存在一些较大 的致密颗粒中。
积累的Ca2+ 又可以通过钠－钙交换系统和膜转运 孔道再次释放到胞质，从而调节胞浆中钙离子的 动态平衡，影响细胞内许多相关的生理活动，如 信号传导、能量代谢和细胞凋亡。 Ca2+能结合线粒体膜转运孔道上的金属结合位点， 开放膜转运孔道，从而诱导渗透压的改变、ATP 的耗竭和线粒体的皱缩，细胞色素 C释放，活化 Caspase 9和Caspase 3，诱发细胞凋亡。
基质（matrix）
三羧酸循环：除糖酵解在细胞质中进行外，其他 的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸 循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中。 线粒体基因组：基质具有一套完整的转录和翻译 体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖 体，tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶等。 存储钙离子的致密颗粒。
线粒体结构
线粒体是真核细胞的一种细胞器，包括四个功能 区隔 :外膜、内膜、膜间隙和基质。
主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占 65-70%，脂类占25-30%。
外膜 (out membrane)
膜孔蛋白（porin）、离子通道蛋白以及Bcl-2 家 族蛋白。
由膜孔蛋白构成的亲水通道，允许分子量为5KD 以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。
STZ rats, 观察时间：4，8周
肾组织:
8-羟基脱氧鸟嘌呤 (8-OHdG，kidney and urine) Mitochondrial DNA Deletion COX I/COX IV(mt DNA/nDNA)
Maiko Kakimoto, Toyoshi Inoguchi, Toshiyo Sonta. Accumulation of 8-Hydroxy2’-Deoxyguanosine and Mitochondrial DNA Deletion in Kidney of Diabetic Rats. Diabetes 51:1588–1595, 2002
糖尿病肾病
glucose-induced ROS initiates mesangial cells apoptosis glucose-induced ROS initiates podocyte apoptosis and depletion glucose-induced ROS initiates endothelial cell apoptosis glucose-induced ROS initiates tubular cells apoptosis
doxorubicin nephrosis rats
肾组织：
NADH dehydrogenase(complex I) cytochrome-c oxidase (complex IV) COX I mtDNA levels mtDNA deletion
Dirk Lebrecht1, Bernhard Setzer1, Rolf Rohrbach, et al. Mitochondrial DNA and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis. Nephrol Dial Transplant, 2004, 19: 329–336
内膜 （inner membrane）
电子传递链(呼吸链)复合物I~IV 和复合物V(ATP 合成酶)。
通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过， 大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。
膜间隙(intermembrane space)
细胞色素C 电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ADP/ATP转 换蛋白。 线粒体膜转运孔道(mitochondrial permeable transition pore，MPTP)存在于内外膜接触点。 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)和 Procaspase 2、3、9 及其他酶蛋白。
氧化应激
8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG，ELISA法) ROS(分光光度法) glutathione and coenzyme Q(分光光度法, HPLC)
凋 亡
细胞色素C含量（western blot) caspase-9 and caspase-3 (分光光度法) BCL-2(免疫组化，western blot) BAX (免疫组化，western blot) 膜转运通道开放程度(分光光度法) Ca++(分光光度法) 膜电位
High glucose－mitochondrial ROS－kidney cells apoptosis
7 cases, clinical diabetes was 5.6±0.6 years 胰岛组织:
Nitrotyrosine level(硝基酪氨酸, marker of oxidative stress) complex I and complex V ATP/ADP ratio Uncoupling protein-2 (UCP-2) expression membrane potential
线粒体功能
能量供应 氧化应激 凋亡 钙储池 细胞周期、信号转导 肿瘤 发育等
线粒体与能量供应
细胞有氧呼吸和供能的场所，供应细胞生命活 动95%的能量。
线粒体的主要功能是把氧化各种底物产生的自 由能转化为可被细胞直接利用的形式－ATP。 线粒体具有能量代谢与自由基代谢两条途径。
M. Anello et al. Functional and morphological alterations of mitochondria in pancreatic beta cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia, (2005) 48: 282–289
mtDNA突变 呼吸链复合体I～IV活性下降 ATP合成减少 氧自由基产生增多 钙稳态失衡 脂质氧化增强
线粒体病理性损伤
II型糖尿病
胰岛β细胞线粒体参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗的 形成。 线粒体是高血糖时细胞ROS的重要来源。 线粒体氧自由基增多与糖尿病微血管并发症的发病 机制相关。 线粒体本身受氧化应激攻击，导致mtDNA 合成减 少、发生突变。
这些都是启动细胞凋亡的因素。
线粒体与凋亡
从线粒体释放的细胞色素C与凋亡诱导因子、 Procaspase 9结合在一起形成“凋亡体” （Apoptosome），导致Caspase 9和Caspase 3的激 活。 内膜Bcl-2 家族蛋白调控紊乱。 Caspases激活、胞浆Ca++水平升高、产生神经酰胺， 直接或间接地引发膜转运孔道持续开放。
线粒体功能检测
能量供应
enzyme activity assays(分光光度法)
NADH (complex I), succinate dehydrogenase (complex II) 细胞色素c还原酶 (complex III) COX (complex IV)
ATP （ luciferin/luciferase发光法，核磁 共振法） 呼吸控制率(ATP 合成功能，氧电极法)
线粒体功能紊乱
线粒体病（primary genetic defects）
线粒体病理性损伤
线粒体病
mtDNA突变(点突变、缺失、插入）导致线粒体功 能缺陷。如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病、 老年性痴呆、帕金森病、糖尿病等。 mtDNA突变随着年龄累积。
线粒体功能变化
线粒体DNA
线粒体基因组
哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子，几乎 每一对核苷酸都参与一个基因的组成。
线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋 白质。 仅有少数线粒体蛋白质是由mtDNA编码，大多 数线粒体蛋白质（90%）还是由核DNA编码。
mtDNA
环状，编码2 种rRNA、22 种tRNA和13 种参与呼 吸链形成的多肽。 通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完 善的自我修复系统，又靠近内膜呼吸链，极易受 环境影响，突变频率比nDNA 高10~20 倍。 如果线粒体DNA发生突变，不能产生足够ATP 而导致细胞功能减退甚至死亡，临床上表现复杂 多样，即线粒体病。 母系遗传。
①燃料分 解（胞质 中）
葡萄糖
②乙酰 CoA生成
③三羧酸循 环(线粒体基 质)
脂肪酸
氨基酸
④电子传递和 氧化磷酸化(内 膜上)
生成ATP
线wk.baidu.com体与氧化应激
线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位，消 耗氧用于合成ATP的同时不可避免地产生活性氧。
氧化应激作用下，膜转运孔道开放造成线粒体基 质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼 吸链脱偶联，能量产生中断。 还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜 破裂，通透性增高，释放出包括细胞色素C在内 的各种活性蛋白。
mtDNA
levels of mtDNA(PCR) mtDNA deletion(PCR) COX I/COX IV(PCR，免疫组化， western blot)
Thank you
过多自由基的产生可导致mtDNA的损伤，氧化损 伤是mtDNA突变的主要原因。
线粒体本身也极易受氧化应激的攻击。
活性氧在启动和调节细胞凋亡的过程中扮演着重 要的角色。
活性氧的积累可以导致：
线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生；
细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质中； BAX表达，caspase活化等。
体外培养肾小管上皮细胞
ATP 膜转运通道开放程度 cytochrome c caspase 3 Ca++
Peraza MA, et al.Morphological and functional alterations in human proximal tubular cell line induced by low level inorganic arsenic: evidence for targeting of mitochondria and initiated apoptosis. J Appl Toxicol. 2006, 26(4):356-67
ROS－膜转运孔道持续开放－凋亡
钙储池
线粒体感受到钙微区，通过膜上协同转运体将钙 摄入基质，然后以磷酸钙的形式储存在一些较大 的致密颗粒中。
积累的Ca2+ 又可以通过钠－钙交换系统和膜转运 孔道再次释放到胞质，从而调节胞浆中钙离子的 动态平衡，影响细胞内许多相关的生理活动，如 信号传导、能量代谢和细胞凋亡。 Ca2+能结合线粒体膜转运孔道上的金属结合位点， 开放膜转运孔道，从而诱导渗透压的改变、ATP 的耗竭和线粒体的皱缩，细胞色素 C释放，活化 Caspase 9和Caspase 3，诱发细胞凋亡。
基质（matrix）
三羧酸循环：除糖酵解在细胞质中进行外，其他 的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸 循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中。 线粒体基因组：基质具有一套完整的转录和翻译 体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖 体，tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶等。 存储钙离子的致密颗粒。