酶联免疫分析法

第七章
酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述 第二节 光度酶联免疫分析 第三节 发光酶联免疫分析
第一节 酶联免疫分析概述
一、免疫分析 1、免疫分析发展史 • 免疫分析（ Immunoassay ， IA ）是利用待测物质（抗 原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专一 特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。 • 免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学 试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。 • 宋代 人工痘苗预防烈性传染病天花 • 1971 年 第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物 学分开发展成一门独立的学科。
第一节 酶联免疫分析概述
酶联免疫分析常用酶
酶 辣根过氧化物酶 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 β-D-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 脲酶 青霉素酶 过氧化氢酶 葡萄糖淀粉酶 碳酸苷酶 乙酰胆碱酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 溶菌酶 苹果酸脱氢酶 无机焦磷酸酶 荧光素酶 丙酮酸激酶 来源 辣根 动植物 牛肠 大肠杆菌 曲霉菌 Jack豆 — 肝 根霉菌 牛红细胞 — 肠系膜明串细菌 鸡卵白 猪心线粒体 大肠杆菌 发光生物 哺乳动物组织 EC编号 1.11.1.7 3.1.3.2 3.1.3.1 3.2.1.23 1.1.3.4 3.5.1.5 3.5.2.6 1.11.1.6 3.2.1.3 4.2.1.1 3.1.1.7 1.1.1.49 3.2.1.17 1.1.1.49 3.6.1.1 1.3.12.7 2.7.1.40
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 • 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白都是抗体。 • 例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不 是抗体，尽管其结构与抗体相似。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中 也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得 抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 放射免疫分析法 1、免疫分析法分类
化学发光免疫分析法 标记免 疫分析 免疫 分析 电化学免疫分析法 荧光免疫分析法 竞争性酶联免疫分析 酶联免疫 分析法 非竞争性酶联免疫分析 均相酶联免疫分析 非均相酶联免疫分析 非标记免疫 分析 沉淀反应、凝集反应、 免疫电泳、免疫扩散
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗原、抗体发生如下免疫反应： Ag-Ab • Ag+Ab • 该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学 基本原理，其反应式为 [Ab - Ag] k1 K [Ab][Ag] k2 • 式中：[Ab]为游离的抗体结合位点的浓度；[Ag]为游 离的抗原结合位点的浓度； [Ab-Ag]为抗原-抗体复合 物的浓度； k1为正反应速率常数； k2为负反应速率常 数；K为反应平衡常数（亲和常数）。
第一节 酶联免疫分析概述
⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生 反应的干扰物质； ⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉； ⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗 原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。
第一节 酶联免疫分析概述
（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记 酶的质量。 • RZ表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的 比值。 • 酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每1ml酶液所 具有的酶活性单位数。 （3）酶联免疫分析中的常用酶 下表列出了酶联免疫 分析中的常用酶。其中EC编号是根据国际酶学委员会 的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。
第一节 酶联免疫分析概述
2、抗原、抗体与免疫反应 • 抗原是能够引起免疫反应的分子。 • 免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产 生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 • 具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。 • 免 疫 反 应 原 性 （ immunoreactivity ） 或 抗 原 性 （ antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合，引起免疫反应的性能。 • 具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反 应性的物质被称为半抗原（hapten）。
第一节 酶联免疫分析概述
2、酶标记免疫分析法中使用的酶 （1）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件： ①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强； ②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子 偶联后仍保持较高的催化活性； ③使用稳定性和保存稳定性好； ④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速； ⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；
第一节 酶联免疫分析概述
• 这种抗原-抗体反应既可发生于体内（in vivo），也 可发生于体外（in vitro）。 • 抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采 用血清做试验，所以体外抗原 - 抗体反应也称为血清 学反应（serologic reaction）。 • 基于抗原 - 抗体反应的检测技术主要应用于以下几个 方面：①用已知抗原检测未知抗体； ②用已知抗体检测未知抗原； ③定性或定量检测体内各种大分子物质； ④用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。
第七章
Hale Waihona Puke Baidu
酶联免疫分析法
• 基本要求： • 了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的 原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析 法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相 载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液 及ELISA法常用酶的底物系统，掌握ELISA的酶联方法 和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握ELISA 的定量计算，了解 ELISA 的灵敏度提高途径，熟悉 ELISA 放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化 学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的 标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常 用的生物发光反应体系。
第一节 酶联免疫分析概述
• “免疫（immunity）”一词源于 “immunitas”，原 意是免除税赋和差役。 • 研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。 • 20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物 的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、 免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 • 现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“ 异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和 ，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。