PCR技术用于基因突变的检测

PCR技术用于基因突变的检测
PCR 技术用于基因突变的检测
基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因结构多态性异常等形式。

许多人类遗传性疾病源于基因的突变,基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列等位基因改变的鉴别,对诊断和理解遗传病有非常重要的价值。

聚合酶链反应 (PCR)是一种高特异和高灵敏性的基因分析手段, PCR 操作简便, 可以在几个小时内使 DNA 段的拷贝数扩增百万倍, 使对微量 DNA 的分析鉴定成为可能,伴随着分子生物学各领域的飞速发展, PCR 及其衍生技术以其快速准确在基因突变的检测中得到了广泛的应用。

虽然特异基因序列区段的直接测序是基因突变分析最可信和最精确的手段 , 但该方法繁琐、耗时、费力。

PCR 的应用则提供了一系列比直接测序更方便、快捷的方法。

PCR 在此领域也引起了巨大的革新。

基于 PCR 技术的常用基因突变检测方法有:
1、 PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸 ) PCR/ASO探针诊断点突变,系在扩增 DNA 段后,直接与相应的寡核苷酸探针杂交,来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。

2、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR-SSCP 系 1989年由 Orita 首先报道的,它是一种基于单链 DNA 构象差别来检测点突变的方法。

该方法操作简单、灵敏且特异性高,是目前检测点突变最简捷的方法。

3、 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism , RFLP , 限制性片段长度多态性分析 )RFLP 分析与 PCR 反应相结合, 先用 PCR 来扩增待检的片段,再进行 RFLP 来检测那些发生在酶切位点的突变简化了 RFLP 的分析过程,并使该项技术得到了广泛的应用。

4、 DNA 序列测定法 (direct sequencing, DS)
PCR 产物经克隆后测序或直接对 PCR 产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的,不仅可以确定突变的部位,还可以确定突变的性质。

尤以循环测序法最具有代表性,该方法以 TaqDNA 聚合酶代替测序酶。

测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成,具有快速、简便、灵敏等优点。

但是DNA 序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。

5、异源双链分析 (heteroduplex analysis, HA) 该方法类似于 SSCP 。

在一个PCR 反应中, 如果同时存在野生型和突变型的 DNA 模板, 那么在 PCR 循环中突变型和野生型 DNA 形成的杂合双链 DNA 分子即异源双链 DNA 段, 它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率,经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开,从而达到诊断碱基突变的目的。

该方法依赖于双链 DNA 分子序列依赖性的构象变化。

对于小于 300bp 的小 DNA 段其敏感性较好,且已在许多遗传性疾病中得到应用。

6、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)DGGE 是一项根据 DNA 解链特性分离鉴定 DNA 段的技术。

在温度和变性剂浓度增加时, DNA 分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。

PCR 扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时,一旦
进入相当于某些区域解链温度 (Tm)的变性剂浓度区将会解链形成分叉的 DNA 分子, 并因此使迁移率显著下降。

变性区域的解链温度 (Tm)由其核苷组成决定, 序列中发生一个碱基的改变,其解链温度 Tm 改变1.5℃,在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。

同 SSCP 比较, DGGE 需要制备新鲜的梯度胶,检出率也较低,且只能确定突变的存在,不能进行突变位置和性质的定量分析。

但 DGGE 无需知道待测片段的 DNA 序列,无需制备测试引物。

7、化学错配裂解法 (chemical mismatch cleavage, CMC) CMC是将同位素标记过的野生型 DNA 分子和突变型 DNA(或 RNA) 段混合后经过变性与复性 , 形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 的异源杂交双链,在突变部位会产生凸起。

对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。

CMC 法最大优点是能对放大片段进行“ 扫描” 式分析 , 存在于序列中任何部位的突变都能被检出 , 多用于多基因突变的遗传病。

此外还有等位特异性 PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、 PCR 核糖体分型(ribotyping)技术、可变数目 ***重复 (variable number tandem
repeats,VNTR) 序列和短 ***重复 (short tandem repeats,STR) 序列分析等方法可用于基因突变的分析。

这些方法各有所长,具有不同的优缺点, 在不同的领域内有着不同的应用。

无论是哪种检测技术都体现了 PCR 技术本身所具有的优越性 , 在实际应用时,可根据实验目的和具体需要,选择最恰当的方法或将不同的方法联合应用, PCR 的应用将使基因突变检测技术有更广阔的应用前景。