成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

３ ４ ９的基础 上 ，利 用 Ｒ ｄ 组 系统 ，从 此克 隆上 将一段 ｌ ． ｋ 无启 动子 的 ＨＧ Ｒ 基 因组 片 ０ Ｍ１） ｅ重 ２５ ｂ ＰＴ
段克 隆到 ｐ 一 粒 上 ，产生 ｐ － Ｐ Ｔ质粒 。然后基 于 ｐ ． Ｐ Ｔ ｐ ＧＦ — ．Ｄ１１ 质 ＫＳ质 ＫＳＨＧ Ｒ ＫＳＨＧ Ｒ 和 Ｅ ＰＣ１Ｓ ２ １
和 绵羊 的 ＧＧ ＡＴ１ 因［￣ 】 基 １ １，牛和 绵羊 的 Ｐ ＮＰ基 ５７ Ｒ 因【 也通 过类似 的技 术路线被 敲 除，获得 相应 的 ｌ ７ 】
［ 通讯作者］ 陈学进， 博士， 男， 研究员， 究方 向： 研 发育生物学 。 Ｅｍａｌ ｈｎ ｕｊ ａｏ ． ｍ． — ｉ ｃ ｅｘ ｅ ： ＠ｙｈ ｏｃ ｃ ｏ ａ 姚 刚 ， ， 士 ， 授 ， 究方 向： 男 博 教 研 动物 生物 化 学
步鉴 定 ，获得 ８ 个发 生 同源 重组 的细胞克 隆 ，还 需利用 Ｓ ｕｈｒ ｌｔｎ ￣ 进 一步验证 。 论 ｏ ｔｅｎｂｏｔ ｇ ｉ 结 成
功快速地构建 了捌 基 因敲除型打靶载体，为下一步进行体 细胞核移植制备 ＨＧ Ｒ 基因敲除 ＰＴ 转基 因克隆 兔奠定基 础 。
［ 词】 因敲 除； 关键 基 兔成 纤维体 百度文库胞 ； 次黄 嘌呤 一 嘌呤磷 酸核糖 转移 酶 ； 鸟 细胞 筛选
［ 摘要］ 目的 构建兔Ｈ Ｒ 基 因打靶载体 。 ＰＴ 方法 在 已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤 一 鸟嘌呤磷
酸核 糖转 移酶 （ ｙ ｏ ａ ｔｉｅ ｕ ｎｎ ｈ ｓｈ ｒ ｏｙ ｔ ｎｆｒｓ ，ＨＧ Ｒ Ｈ ｐ ｘ ｎｈｎ ａ ｉｅ ｏｐ ｏｉ ｓｌｒ ｓｅａｅ ｇ ｐ ｂ ａ Ｐ 基 因 Ｂ ＡＣ克 Ｉ Ｌ ＮＬ — ｔ Ｂ ￣（ １
（ ．９ ４ ９ １ ０ ） Ｎｏ０ １ ０ ０ ０ ０
或 医学 奖 。利用 小 鼠胚胎 干细 胞（ ｓ， 因打靶 在 Ｅ ）基
精确 改造 小 鼠基 因组 中的应 用 已十 分成熟 。然而大 型 哺乳动 物 的 Ｅ Ｓ细胞 因其难 以分 离和培 养ｌ 至今 ３ ｊ ， 尚未 获得 能够进 入 生殖系 并稳定遗 传 的 Ｅ Ｓ细 胞【。 】 １９ ９ ７年克 隆羊 多莉诞 生 以来［， ５ 哺乳 动物体 细 】
Ａ ｇ ０ ０ ０４ ｕ ． １． （） ２ ３
实验动物与 比较 医学 Ｌ ｂ ｒｔｒ Ａ ｉ ｌ ｎ ｏ ｐ ｒｔ ｅ ｄｃ ｅ ａｏａｏｙ ｎｍａ ａｄＣ ｍ ａａ ｖ ｉｉ ｉ Ｍｅ ｎ
・
２３ ３
ｄ ｉ ０３ ６ ／ｉ ｎ１ ７ —８ ７ ０ ００ ．０ ｏ： ．９ ９ ． ｓ．６ ４５ １ ． １．４０ １ １ ｊｓ ２
种 新 型 分 子 生 物 学 技 术 ，其 原 理 是 应 用 外 源
Ｄ Ａ与受 体细胞基 因组上 的同源 序列之 间可 以发 生 Ｎ 同源 重组， 从而使 外源 Ｄ ＮＡ整合 到受 体细胞基 因组 的特 定位 点上， 实现精 确 、定 向的基 因删 除或替代 ，
【 收稿 日期］ ０ ００ ．２ ２ １．１１ ［ 基金项 目】 国家 自然科学基金（０ ７ ３ ４； ３ ７ ０２ ）上海市科委 基础 研究重点项 目ｆ８Ｃ１ １９ ０和上海市科技兴农 ０ Ｊ ４ ３ ０） 重点攻关项 目（ 沪农科攻字（０ ６第 ５３ ； ２０ ） － 号） 上海 市重点学科建设项 目（３ ２ １； ￥ ０ ０）上海市科委资助
粒， 构建了含有绿 色荧光蛋白（Ｆ ） Ｇ Ｐ及新霉素（ｅ） ｎｏ筛选标记基 因的打靶载体ｐ ＳＨ Ｐ Ｔ Ｆ —ｅ。 Ｋ － Ｇ Ｒ － Ｐｎｏ Ｇ 结果 将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基 因组 中， 利用Ｇ １ ４８ 及 ６Ｔ 一Ｇ进 行 细胞 克 隆 的抗 药物 筛选 ，共得 到抗 性 细胞 克 隆 ２ 个 。 细胞 克隆进 行 Ｐ Ｒ及 测序初 ０ 对 Ｃ
论 著 ・
成体兔次黄嘌呤 一 乌嘌呤磷酸核糖 转移酶基 因的打靶研 究
王 伟 张传 山ｚ郭 毅，谷瑞环 ｓ丁 雷 ， ， ， ， ， 姚 刚 ， 陈学进 （． １新疆农业大学动物医学学院， 乌鲁木齐 ８０ ５ ； ． ３ ０２ ２ 新疆 医科大学一附院医学研究
中心新疆包虫病基础 医学重点实验室， 乌鲁木齐 ８０ ５； ． ３ ０２ ３上海交通 大学医学院实验动物科学部， 上海 ２ ０２ ； ． ０ ０５ ４ 东北林业大学野生动物资源学院， 尔滨 １０４） 哈 ５００
胞核移植技术在近十年 多来取得 了长足 的进展， 已陆
续在 牛［ 、 【 猫 【 、 引、 【］ 狼 【 、鹿 【］ ６ 猪 、 引 ｌ 兔 、 】 。 １、 ２
雪貂［］ 动物 上成 功获得 体细胞 克隆动物 。并且 通 １ ３ 等
过核移植技术与转基 因技术 的结合， 为生产转基 因动 物提供 了一 条崭新 的途径 。 ０ ０ ， Ｃ ｅｔ 『 ２ ０ 年 Ｍｃ ｒａｈ等 ｌ ４ ］
［ 中图分 类号］ ５３ ［ Ｑ９ －３ 文献标 识码］ Ａ ［ 章编号 ］ ６ ４ ５ １ （０ ００ —２ ３０ 文 １ ７ —８ ７２ １）４０ ３ —８
基 因 打靶技 术是 上世 纪 ８ ０年代 末发 展起 来 的
一
而 不 累及其 它基 因【 】 ａ ｅ ｃ ｉ 三位 科学 家也 １ 。Ｃ ｐ ｃｈ 等 ’ ｚ 因开创 了基 因打靶 技术而 荣获２ ０ 年诺 贝尔生理学 ０７
［ 作者简介］ 王
伟（９４）男， １８ 一 ， 汉族， 硕士研 究生， 专业方 向：
生物 化 学 和 生 理 学 。 Ｅｍａｌｄａｇ ｎ ｎｇ ａ ｏ ． ｍ． — ｉ ｒｎ ｏｗａ ＠ｙｈ ｏｃ ｃ ： ｏ ｎ
通 过绵羊 胎儿 成纤 维细胞 的基 因打靶 ，将含 有人 的 Ｏ 抗胰蛋 白酶基 因的乳腺特 异表达框架插 入到绵羊 【 １ 的 １ Ｉ 前胶 原 （ ＯＬ１ ） 因位 点 。此 后 ，猪 （ ） Ｃ Ａ１基