2 2核酸提取及常见问题分析OK
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? 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
? 基因组DNA的提取
? CTAB法 ? SDS法 ? 其它
DNA提取的几种方法
? 非基因组DNA的提取 ? 质粒DNA的提取
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
质粒DNA－煮沸法
? 煮沸法原理
? 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
? 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0 ）
EDTA （pH8.0 ）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1% （V/V） 使用前加入
? Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ? EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ? NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ? β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0 ）
EDTA （pH8.0 ）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（ V/V） 使用前加入
? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
? 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15℃。
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB提取缓冲液的经典配方
核酸提取及常见问题分析
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息 分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核 酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最 基本的操作 。
SDS 2%
基因组DNA－SDS法
? SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
? 根据细胞裂解方式的不同有：
? 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ? 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ? 生物方式：酶法
? 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
? 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
? 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
? 碱裂解法原理
? 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
? 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
? 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNБайду номын сангаас－碱裂解法
? 碱裂解法流程图
对数期菌体
?碱裂解法 ?煮沸法
? 线粒体、叶绿体DNA的提取
?差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
? CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
? 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
? 上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
? SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
? SDS法原理
? SDS是一种 阴离子去垢剂 ，在高温（ 55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
基因组DNA－其它方法
? 根据核酸分离纯化方式的不同有：
? 吸附材料结合法：
? 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
? 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
? 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
? 差速离心法原理
? 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
? 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
? 基因组DNA的提取
? CTAB法 ? SDS法 ? 其它
DNA提取的几种方法
? 非基因组DNA的提取 ? 质粒DNA的提取
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
质粒DNA－煮沸法
? 煮沸法原理
? 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
? 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0 ）
EDTA （pH8.0 ）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1% （V/V） 使用前加入
? Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ? EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ? NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ? β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0 ）
EDTA （pH8.0 ）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（ V/V） 使用前加入
? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
? 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15℃。
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB提取缓冲液的经典配方
核酸提取及常见问题分析
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息 分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核 酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最 基本的操作 。
SDS 2%
基因组DNA－SDS法
? SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
? 根据细胞裂解方式的不同有：
? 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ? 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ? 生物方式：酶法
? 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
? 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
? 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
? 碱裂解法原理
? 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
? 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
? 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNБайду номын сангаас－碱裂解法
? 碱裂解法流程图
对数期菌体
?碱裂解法 ?煮沸法
? 线粒体、叶绿体DNA的提取
?差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
? CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
? 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
? 上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
? SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
? CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
? SDS法原理
? SDS是一种 阴离子去垢剂 ，在高温（ 55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
基因组DNA－其它方法
? 根据核酸分离纯化方式的不同有：
? 吸附材料结合法：
? 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
? 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
? 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
? 差速离心法原理
? 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
? 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策