黄曲霉毒素标准检测规程

黄曲霉毒素标准操作规程

1、目的

为了规范亲和柱净化样本中黄曲霉毒素的操作流程，特制订本操作规程。

2、范围

本标准适用于粮食、饲料、中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测。

3、检出限和定量限

项目

岛津安捷伦

样本检出限

（µg/kg）

样本定量限

（µg/kg）

样本检出限

（µg/kg）

样本定量限

（µg/kg）

AFG10.12 0.4 0.9 3.0

AFG20.08 0.2 0.3 0.86

AFB10.08 0.2 0.6 1.97

AFB20.04 0.12 0.2 0.63 部门名称部门职责

质量管理部1、负责本制度的实施。

2、负责本制度的监督执行。

5.1 原理

测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素B1经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素B1，然后注入到分析仪器中用于检测。

5.2 溶液配制

5.2.1 70%甲醇-水溶液：取700mL甲醇，加入300ml去离子水混匀即可。

5.2.2 80%乙腈-水溶液：取800m乙腈，加入200ml去离子混匀即可。

5.2.3 1% 吐温-水溶液：取1ml 吐温-20，加入去离子水并定容至100ml。

5.2.4 黄曲霉毒素混合标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到50 ng/ml、

20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml。

5.3 样品前处理

5.3 1 适用于玉米、小麦等粮食作物，花生及其制品，坚果、玉米油、花生油、饲料等

样品

----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛），加入5g 氯化钠与125mL 70% 甲醇-水溶液混匀；

----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----取10mL 滤液加入20mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取15mL 上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：1

5.3.2 适用于辣椒、花椒、黄豆酱等调料，面粉、麦芯粉、芝麻油及其它植物油、谷草

等样品

----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入125mL 80%乙腈-水溶液混匀；

----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----取10mL 滤液加入40mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：1

5.3.3 适用于中药（2015 版药典规定的19 味中药等）

----15g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入75mL 80%乙腈-水溶液混匀；

----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----取10mL 滤液加入40mL 1% 吐温-水溶液，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：1

5.3.4 适用茶叶样品：

----10g±0.01g 加入2g 氯化钠，加入纯甲醇溶液100mL，混匀；

----高速均质（≥10,000r/min）均质1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速滤纸过滤，收集滤液；

----取10mL 滤液加入40mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：2

5.4 净化

----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上；(3mL 的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)

----将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；

----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

----待液体排干后，用10mL去离子水洗涤2次，流速2～3滴/秒；对于颜色附着比较深的样品，先用1% Tween-20 水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL 流速2～3滴/秒；

----待液体排干后，上样1mL 甲醇，流速1 滴/秒，收集洗脱液并定容至1mL；

----洗脱液用0.22μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。

* 每次上样前都要将上次液体完全排干。

5.5 液相测定

5.5.1 液相色谱条件

C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；

流动相：55%甲醇（AFB1）；53%甲醇（AFT）

流速：0.8mL/min；

柱温：40℃；

进样体积：20µL

荧光检测器：激发波长：360nm；

发射波长：440nm；

5.5.2 色谱定量

分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的峰面积带入标准曲线，得到试样中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的浓度，标准品色谱图参考下图：

数据文件名:AFT-B1-10ppb.lcd

样品名:AFT-B1-10ppb

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5min

0510152025mV

检测器A Ex:360nm,Em:440nm A F G 2

A F G 1

A F

B 2

A F

B 1

5.6 注意事项

----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。 ----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。 ----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。 ----柱容量：300ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降

低上样液的体积，重新检测。

----pH ：亲和柱的上样溶液pH 需在6～8 之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调

节pH 。

----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。 ----黄曲霉毒素B 1 可致癌，应戴手套操作。

----使用过的容器及黄曲霉毒素B 1 溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V ）浸泡过夜。 6、

相关文件

《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、

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