显微镜技术进展

显微镜技术进展报告

OLYMPUS 北京 齐冬 200907 自从Ernst Abbe （1873，1884）构建了现代显微镜的基础后，显微镜及其相关显微镜技术被广泛应用于生物学及其相关领域，其后相继产生的反差增强技术，如相差技术（Zernicke, 1935）、DIC 技术（Normarski, 1955）、浮雕相衬技术（Hoffman, 1975）等方便了未经染色的活细胞、活组织的观察，这些技术改进都推动了生物学技术的进步。近期，荧光技术及数字图像采集和处理技术的发展，更是极大的激活了以活细胞、活体研究为基础的现代生物学技术。荧光技术的广泛使用和广阔应用前景都使得荧光相关的技术改进成为现代显微技术发展的新推动力，许多新近的生物显微镜技术多是围绕着荧光展开的。

激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜（（LSCM, Laser Scanning Confocal Microscope ）：

LSCM 是光学显微镜的重大改进，在不改变普通荧光显微镜的制片方法的前提下，可以观察到非常清晰的高质量图像，主要表现为可以观察活细胞、固定细胞和组织的深层结构，并且可以得到清晰锐利的多层Z 平面结构，既光学切片，并以此可以构建标本的三维实体结构。

对于普通场式光源显微镜来说，标本非焦平面信息的干扰是不可避免的，LSCM 最核心的技术是通过空间过滤技术（针孔）去除了一定厚度标本的非焦平面信息，并且通过驱动激光或移动标本平台等方法可以实现标本的清晰平面成像。

激光刺激相关研究 (Stimulating)

LSCM 使用了扫描技术，所以通过控制激光照明强度、扫描位置等方法，实现对标本荧光的精确定位控制。通过这种精确的定位控制，我们可以对特定部位进行漂白操作，我们可以观察荧光漂白后的恢复过程（FRAP ），或者观察持续荧光漂白的整体荧光变化（FLIP ），并可以由此分析出标本个部位的动力学特点。在光转化和光活化实验中，选择感兴趣区域进

行刺激的比较理想操作方法是使用声光调制器（AOTF，acousto-optic tunable filter），用它可以非常方便的定义圆形、椭圆、方形和其他自由形状区域对标本进行光刺激。

近年来随着蛋白质学研究的进展，研究人员相继发现和特异克隆了一些特殊蛋白，这些蛋白在特殊的激光刺激下会产生一些特异性的变化，如亮度变化、颜色变化等。随着这些蛋白的产生，一些以往难以操作，甚至不能完成的科学研究已经变为可能。这些研究包括：荧光团、荧光抗体和GFP融合蛋白等标记的膜成分扩散运动；膜蛋白及脂质成分研究；亚细胞膜；脂质重建；细胞质内扩散运动；胞间信息交换；检查内质网、细胞核和细胞质等区室边界等。

但常规的AOTF光操作方式只有一束激光扫描，刺激和取图要共用同一对XY扫描振镜，所以刺激和扫描只能分开在不同时间段进行。这样操作存在几个弊端：第一，刺激的同时无法观察细胞反应；第二，无法确定细胞确切的受诱导状态，经常需要在刺激和取图之间反复切换，以获取最佳的诱导状态；第三，由于在AOTF/ZOOM诱导和常规取图之间切换有明显的时间延迟，所以该方法对快速反应无能为力；第四，刺激激光和取图激光都使用XY振镜，并且使用同样光路，所以刺激速度和效率都受到限制。

近期出现的同步双扫描装置，除XY扫描振镜外，另外引入一个同步扫描头，新的扫描头与XY振镜各自独立工作，只进行光刺激功能。这样就解决了以往用AOTF或ZOOM方式进行光刺激工作时必须在取图和刺激间频繁切换的问题，提高了刺激效率、节省了操作时间。最大的优点是可以在刺激标本的同时，不影响正常的图像获取，可以在刺激的同时看到标本的瞬间变化，为FLIP/FRAP/Keade蛋白/PA-GFP蛋白/解笼锁(uncaging)等光刺激研究提供了最佳的解决方案。

多光子多光子激光激光激光扫描显微镜技术扫描显微镜技术扫描显微镜技术（（Multi-Photon Scanning Microscope ）

多光子激光扫描显微镜，是建立激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，在三维观察上提供了更优秀的光学切片能力。多光子荧光激发方法使用长波长的红光或近红外光采集标本高分辨率荧光图像，对活性标本的杀伤极小，因此非常适用于活细胞成像，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官甚至整个机体的成像研究。

多光子显微镜有许多LSCM 不具备的特点：从激发光源开始，多光子显微镜使用飞秒超快脉冲红外激光，通过物镜（一般是长工作距离红外校对的水浸物镜）在焦点位置形成瞬间高光密度，而在激发焦点之外则不产生激发荧光，这样在荧光采集上就不需要共聚焦显微镜的空间针孔，因此采集效率更高，对荧光散射光的收集范围也更宽。上述诸多特点保证了多光子显微镜的深度激发和深度荧光采集，成像范围可以达到近300-500um ，远优于LSCM 的几十微米的成像深度。

传统的多光子显微镜存在很多缺陷：由于光学介质的散射作用，激发光在到达焦点时脉冲宽度被大幅展宽，造成激发效率降低；不同波长和不同物镜的后焦平面不能充分匹配；几乎没有高红外光校对的物镜；随着扫描深度增加，激发焦点扩散严重等。一些现代的多光子显微镜可以通过增加负补偿光路、自动扩束装置、红外专门校对物镜和成像深度校正及增加透射荧光检测器等方案解决上述问题，标本的成像深度进一步提高，甚至可以达到近1mm 。

高敏感高敏感快速荧光成像技术快速荧光成像技术快速荧光成像技术——————转盘扫描式共聚焦显微镜转盘扫描式共聚焦显微镜转盘扫描式共聚焦显微镜（（Spinning Disk Confocal ）

LSCM 的成像方式为逐点扫描式，其成像速度取决于扫描速度，虽然单纯加快点扫描速度可以直接提高成像帧频，但由于荧光检测光路较长及PMT 的低检测效率等问题，LSCM 往往通过降低扫描速度或多次扫描的方法提高图像的信噪比。直接提高扫描速度，就必须极

大增加激光强度或提高PMT检测电压才能检测到同等亮度的荧光，但这样会造成严重的荧光漂白、标本杀伤和强烈的背景噪音。

转盘扫描共聚焦显微镜是解决快速成像和薄层光学切片的最佳解决方案。激发光通过转盘上的多个孔洞或狭缝同时照射到标本，标本的荧光在返回时再次经过这些孔洞或狭缝，它们可以作为共聚焦针孔阻挡掉非焦平面光信息。转盘旋转形成多束激发光在标本上同时扫描，转盘每转过一定角度后，激发光即可覆盖整个标本一次，这种多点同时扫描的模式具备高扫描速度的鲜明特点，这种技术通常使用量子效率达到90％的背感光高敏感度的EM-CCD，通过高效采集和高敏感的电子放大技术可以高速的获取极弱荧光图象。转盘扫描式共聚焦配合EM-CCD可以在快速的帧频下获取高信噪比的荧光图像，通常这种组合可以在512X512分辨率下获得高达几十至数百幅/秒的成像速度。

光谱成像技术

随着荧光研究的深入，越来越多的荧光染料和蛋白被开发出来，其发射荧光覆盖的光谱变得越来越广泛，几乎整个可见光波段都有对应的荧光染料发射峰。最近共聚焦厂家纷纷推出了配备光谱功能的共聚焦产品。通过在扫描单元内设置棱镜或高线性度的光栅，将标本荧光按波长分开，使波长信息转换为位置信息，再通过空间过滤的办法可以随意选择合适的荧光波段。

如图，分光镜将标本荧光初步分离；光栅可以将光谱信息精确拆分（提供1nm精确度），并可以延轴向旋转，以便快速的使合适波段的荧光顺利通过PMT前端的滤光狭缝；PMT前端的狭缝宽度可以调整，选择合适宽度的荧光波段。这样可以随意的选择荧光通过波段和带宽，较好的避免了传统滤光片带宽较宽、安装数量有限的限制，适用于所有可以用合适激光激发的标本和染料。

将第分光镜设置为反光镜后，共聚焦可以对标本荧光进行高精度全光谱扫描，可以得到精确到单细胞甚至更小单位的光谱仪效果。通过扫描可以精确分开光谱重叠严重的多重标记荧光，在去除标本自发荧光方面也提供了一个最有效的工具。

（FLIM，Fluorescence Lifetime Imaging Measurement）

荧光寿命测量（

荧光寿命测量

FLIM技术通过固定频率的皮秒（picosecond）或飞秒(femitosecond)脉冲激发，同时使用时间相关单光子技术（TCSPC，Time-Correlated Single Photon Counting）手段，获得荧光分子的寿命信息。