谈谈液相色谱方法开发

谈谈液相色谱方法开发
这次和大家探讨一些关于HPLC方法学开发的问题。

当然，这是很久以前的思路，在今天看来是比较幼稚的，但是，如果能够给大家一点哪怕一点点启示也是好的。

当然文章有很多缺陷，也希望大家批评。

高效液相色谱在极性的角度可以分成正相色谱分析和反相色谱分析。

反相色谱分析一般使用水-甲醇-乙腈体系，一般选用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18键合相柱子。

非极性物质一般用氯仿-正己烷体系。

因为qingqingcao没有做过正相HPLC分离，所以，我们主要关注反相HPLC分析。

色谱柱的选择
当然，选用的色谱柱一般就是C18柱。

长度呢？如果分析的物质复杂，那么可以选取长一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。

保证其分离度。

如果物质不是很复杂，那么选取150mm╳4.6mm╳5μm的色谱柱，可以有效地缩短分析时间。

检测器的选择
紫外检测器是最通用的检测器之一，所以，本文均以紫外检测器做说明。

对于需要分析的物质，做全波长扫描，由于物质的不同官能团，他们会在不同的地方有吸收。

通过综合选取大家都有吸收的波长。

选择波长需要有权衡。

同时也可以用一些特殊的波长，避免杂质的吸收，也可以提升测试准确度。

或者使用双波长的方法。

流动相的选择
对于选取流动相，首先实验一下样品的溶解度。

样品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。

如果，很容易溶解在水中，这就告诉我们，流动相选取，可能有机相要少些，比方说测试维生素C，其极性很强，流动相中有机相比例不能多。

（为了保护色谱柱，有机相比例一般不少于8% ）
如果，样品不太容易溶解在水中，那么有机相的比例应高些，比方像维生素E，就可以用90% -95% 的甲醇体系。

其次是样品的酸碱度。

我们知道，C18色谱柱流动相pH在2-8 之间。

太酸，太碱都可能损坏色谱柱。

流动相pH值对于分离有一定作用，所以，酸性物质，一般流动相酸一些，碱性物质可能碱一些。

对于几种物质的分离。

如果不是太多的物质，用等度方法会比较好。

流动相一般开始选用20mM磷酸缓冲盐-乙腈体系。

（pH一定，流速一定）。

因为乙腈洗脱好，而且粘度低。

通过水相-有机相的比例的改变，观察各色谱峰的分离情况。

这样可以运用无限夹逼法找到最合适的值。

比方说，35：65（ACN：磷酸盐）达到分离，但是还是有部分叠加，那么就微调即可。

当然还要考虑到分析时间问题。

不要为了完全分离而牺牲了分析时间。

所以，在色谱分析，有一个k值（容量因子）。

κ∈（2，20）
如果真的无法改变，那么可以试着微调pH值，来分离。

当然，由于乙腈毒性强，所以通过一定计算，用甲醇同等地接替乙腈。

如果有些物质很靠近死体积，那么需要考虑添加0.02mM离子对试剂，加强物质的保留能力。

流速
一般液相流速在0.8-1.4ml/min。

首选1.0ml/min
柱温
柱温不影响色谱的分离，但是，相对稳定的温度，可以使得保留时间稳定。

进样量
手动进样，只有进样环。

一般也就是20μL。

自动进样的选择很多。

但是，最好不要超过
80μL。

因为进样多，容易造成展宽。

分离物质的浓度
分离物质，不能够太浓也不能太稀。

太浓，容易过载；太稀检测不出。

具体还是根据检测器的响应来调整。

小结
HPLC分析，首先要找到合适的流动相。

流动相既要保证分离，又要关心分析时间。

流动相尽量使用毒性小一点的甲醇。

根据样品和标准品的PH值进行调节流动相溶液酸碱度。

检测波长很重要，要懂得合适的波长。

也就是说，这个单一波长可以分析出所有需要分析的物质。

可以通过波长的调整，规避杂质峰的干扰。

温度和流速都对分离，影响不大。

分离条件摸索好后，就可以开展
1）线性浓度测试
2）精密度测试
3）样品测试
4）回收率测试
5）空白测试。

6）最小检测限，最小检测量
定量的工作比较简单，就是按照以上的思路去操作。

那么一个项目就这么完成了。

当然，这些需要我们的工程师们的努力和智慧。

我希望写的这些东西，能够给初学者一点点启示，当然，如果有错误的话，希望不会误导大家。