结核分枝杆菌

• ③硫酸脑苷脂：可抑制吞噬细胞中吞噬 体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能 在吞噬细胞中长期存活。 • ④蜡质D:是一种肽糖脂和分枝菌酸的复 合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提 出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟 发型超敏反应。
蛋白质
• 有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生 超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症 状，并在形成结核结节中发挥一定作用。
结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)
昆医附一院呼吸内二科 吕树志
历史
• Figure 1-2: Representation of a woman with pronounced gibbus (Pott's disease?). Momil culture, 200 BC to 100 AD, Sinú River, Colombia (reproduced from Sotomayor 1992, with permission).
变异性
• 结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、 免疫原性和耐药性等变异。卡介苗 （BCG）就是Calmette和Guerin 二 人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、 胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次 传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用 于预防接种。
耐药性
• 在固体培养基中对常用的含异烟肼1mg、 链霉素10mg、利福平50mg能生长的 结核分枝杆菌为耐药菌。耐药菌株毒力 有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝 菌酸的合成，诱导结核分枝杆菌成为L型, 此可能是耐异烟肼的一种原因。药物敏 感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平 和链霉素大多仍敏感。
• 2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后: 硬结≤4mm者为阴性； 5-9mm为弱阳性； 10-19mm为阳性； ≥20mm或虽＜20mm，但局部出现水 泡和淋巴管炎，为强阳性。 若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反 之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介 苗接种所致。
• 故结核标本用4% NaOH消化时，一般 细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受 数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还 可抑制吞噬体与溶酶体的融合。
脂质
• 据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质 成分有关，特别是糖脂更为重要。 • ①索状因子 ： 是分枝菌酸和海藻糖结合的一 种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状 排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。 它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制 白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌 中提出，则细菌丧失毒力。 • ②磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中 的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核 结节。
• 结核的免疫属于感染免疫(infection immunity)，又称有菌免疫，即只有当 结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有 免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其 组分全部消失，免疫也随之不存在。 • 随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用 的同时，也可以看到有迟发型超敏反应 的产生，二者均为T细胞介导。
免疫性
• 免疫机制 结核分枝杆菌是胞内感染菌， 其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。 T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与 感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出 结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽 能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌 接触起辅助作用。
• 结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡 中80%～90% 是巨噬细胞，10% 是淋 巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活 化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所 吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核 分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使 周围T淋巴细胞致敏。
• 机体内的T细胞根据抗原受体（TCR）的不同 可分2种：一种由α链与β链组成，称α/βT细胞 （含CD4或CD8标志）,另一种由γ链和δ链组 成，称γ /δT细胞（大多无CD4或CD8标志）。 人与小鼠外周血中前者90%，后者<10%。在 抗分枝杆菌免疫中这2种T细胞均起到重要作 用。在感染早期α/βT细胞尚未升至高峰时，结 核分枝杆菌受γ /δT细胞控制。在与结核分枝 杆菌接触后 γ/δT细胞即大量增殖。健康人经 分枝杆菌提取物刺激7～10d后，外周淋巴细 胞中γ/δT细胞可有所增加，其作用与α/βT细 胞同样可杀伤结核分枝杆菌。
直接涂片镜检
• 标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若 找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般 用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用 IK(intensified Kinyoun)法染色。将石炭 酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s， 则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提 高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微 镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。
一、 生物学性状
• 形态与染色 结核分枝 杆菌为细长略带弯曲的 杆菌，大小1～ 4X0.4m。牛分枝杆菌 则比较粗短。分枝杆菌 属的细菌细胞壁脂质含 量较高，约占干重的 60%，特别是有大量分 枝菌酸包围在肽聚糖层 的外面，可影响染料的 穿入。
分群（Mitchson假说）
• A菌群：快速繁殖， 巨噬细胞外和肺空洞 干酪液化部分； • B菌群：半静止状态， 巨噬细胞内和空洞璧 坏死组织中； • C菌群：半静止状态， 可突然间歇生长。 • D菌群：休眠状态， 不繁殖，数量很少。
• 近年来注意到γ/δT细胞攻击的主要是分枝杆菌 中的一种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)。HSP是一种具有高度保守性 的蛋白质，从原核细胞到动植物中均有，其氨 基酸顺序有50%同源。在正常生物中含量极少， 但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改 变时即大量产生，故HSP又称应激蛋白 (stress protein)。HSP在许多病原菌中均 有，其氨基酸序列有共同成分，不同细菌引起 的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫， 被认为是非特异性免疫。
• 结核分枝杆菌的耐药可由自发突变产生（原发 性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发 性耐药）。但多耐的产生主要可能由于后者。 耐药基因在染色体上，对不同药物的耐药基因 不相连接，所以联合用药治疗有效。 • 对异烟肼耐药与katG基因丢失有关; • 利福平主要作用于RNA多聚酶。编码该酶的 基因(rpoB)突变则引起对利福平耐药。
二、致病性
• 结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致 病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖 引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒 性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤 有关。 • 致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。
荚膜
• 荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋 白质。其对结核分枝杆菌的作用有： • ①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3结 合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上 的粘附与入侵； • ②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的 大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁 殖所需的营养； • ③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核 分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易 进入。
• 阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌， 但应考虑以下情况： ①感染初期，因结核重结核患者或患有其他传染病， 如麻疹，水痘导致的细胞免疫低下 ④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或 肿瘤等用过免疫抑制剂者。
微生物学检查法
• 标本 标本的选择根据感染部位。可取 痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或 胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应 部位分泌液或组织细胞。
免疫与超敏反应
• Koch 现象:将结核分枝杆菌初次注入健 康豚鼠皮下, 10～14d后局部溃烂不愈， 附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表 现为原发感染的特点。若以结核分枝杆 菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感 染 ，则于1～2d内局部迅速产生溃烂， 易愈合。附近淋巴结不肿大，细菌亦很 少扩散，表现为原发后感染的特点。可 见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散， 表明机体已有一定免疫力。但再感染时 溃疡发生快，说明在产生免疫的同时有 超敏反应的参与。
• 近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产 生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反 应主要由结核菌素蛋白和蜡质Ｄ共同引 起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体 RNA引起。二种不同抗原成分激活不同 的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。
结核菌素试验
• 结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来 测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应 的一种试验。 1.结核菌素试剂：旧结核菌素：系将结核分枝 杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加 热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每0.1ml含 5u。目前都用纯蛋白衍化物，PPD有二种： 人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的 BCG-PPD。每0.1ml含5u。 •
• 致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、 IL-6、INF- α，他们与TNF-α的共同作用可 杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INFα是主要的，有多种细胞能产生INF- α，浸润 的先后为NK、Ts/Th和CD4+、CD8+α/βT细 胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产 生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引 起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介 物的产生而将病菌杀死。
• 结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆 菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸 和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热 触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核 分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大 多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性; 非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳 性。
抵抗力
• 结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏 感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可 防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。 粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰 内可存活6～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感， 在液体中加热62～63℃15min或煮沸即被杀 死。结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照 射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书 籍等的消毒。
• 我国建国前死亡率达200-300人/10万， 居各种疾病死亡原因之首，建国后人民 生活水平提高，卫生状态改善，特别是 开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗， 结核病的发病率和死亡率大为降低。但 应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸 毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等 原因，发病率又有上升趋势。
• 1882年3月24日Koch发现结核分枝杆 菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌， 是分枝杆菌属内对人类及动物致病的主 要病原菌。典型的结核分枝杆菌的形态 为细长稍弯曲或直的，两端圆钝的杆菌， 长1～4微米，宽0.3～0.6微米，单个散 在，有时呈X、Y形或条索状。痰标本涂 片经过抗酸染色后在100倍的生物显微 镜下可以看到。
• MDR-TB (耐多药结核),指结核菌至少对 包括异烟肼和利福平在内的两种以上的 抗结核药物产生了耐药性的结核病。 • XDR-TB(严重耐药结核) ,是除耐多药结 核之外对任何氟喹诺酮类药物以及三种 二线注射药物（硫酸卷曲霉素、卡那霉 素和阿米卡星）中至少一种具耐药性的 结核。
持留现象
• 持留性：是结核分支杆菌在感染宿主体 内存留的一种无可争辩的现象。在潜伏 感染或临床感染整个过程中，在“逆境 下保持其在组织内稳定和对环境的无反 应性”。 • 感染潜伏性：任何不表现临床症状的结 核性病变。 • 休眠性：潜伏感染和或患病过程中整体 或病变或病变局部内结核分枝杆菌代谢 和病理学的“静止”状态。
染色
• 分枝杆菌一般用齐尼（ZiehlNeelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸 复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸 乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则 分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中 的物质为蓝色。
培养特性
• 专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃ 不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含 量较高，影响营养物质的吸收，故生长 缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时 18～24h，营养丰富时只需5h。
• 常用的有罗氏 （LowensteinJensen）固体培养基， 内含蛋黄、甘油、马铃薯、 无机盐和孔雀绿等。孔雀 绿可抑制杂菌生长，便于 分离和长期培养。蛋黄含 脂质生长因子，能刺激生 长。根据接种菌多少，一 般2～4周可见菌落生长。 菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不 透明。
生化反应