【6】枯草杆菌溶栓酶的介绍及其生产工艺

溶栓药物治疗
(1) 第一代溶栓剂：链激酶、尿激酶
利：在临床治疗中的应用使血栓性疾病的病死率明显降低 弊：没有溶栓特异性，过多的降解了纤维蛋白原，导致出血 等严重不良反应
(2) 第二代溶栓剂：组织纤溶酶原激活剂、单链尿激酶
利：有一定程度的纤维蛋白特异性 弊：半衰期短等
(3) 第三代溶栓剂：对现有的溶栓药物进行改造
SK是由A，C，G群链球菌中一溶血性链球菌分泌的一类胞外蛋白，它是由414个氨基酸组
成的单链蛋白质，其耐热性强，在100℃下处理10 min仍然能保持活性。SK分子中含有Asp、
Glu，不含cys，其活性中心分别是Asp和His，没有ser残基位点。 一种纤溶酶原激活剂，具有很强的溶解纤维蛋白的能力，其分子量为47kDa。 链激酶含有三个主要的区域分别为α(1-150残基)，β(151-287残基)，y(288-414残基)，必须 三个区域同时和纤溶酶原(plasminogen，Pg)连接才能激活Pg。 SK被广泛的用于心肌梗塞、肺栓塞、静脉血栓症等的治疗。
反渗透膜是从水溶液中除去 无机盐及小分子物质的膜分离 技术。 所用的材料为有机膜，其分 离特点是膜仅能透过水等小分 子溶剂，而截留各种无机盐、 金属离子和分子。其应用领域 已从早期脱盐发展到化工、食 品、医药、造纸工业中某些有 机及无机物的分离。
纳滤介于反渗透与超滤之间， 能分离除去分子量为300～1 000的小分子物质，填补了由 超滤和反渗透所留下的空白部 分网。 纳滤膜集浓缩与透析为一体， 可使溶质的损失达到最小。该 技术是一种新兴的膜分离技术， 在食品、医药、工业废水处理 等领域应用广泛。
02
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因此，需要用膜分离技术进行微生物的浓缩以提取酶制剂。
其他酶制剂
几种常见的膜分离技术
微滤
超滤
反源自文库透
纳滤
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03
04
微滤是最早使用的膜技术， 是以多孔薄膜为过滤介质，使 不溶物浓缩过滤的操作。 截留粒子的范嗣约为 0.1μm～10μm 。在工业中，微 滤膜主要应用于截留颗粒物， 液体的澄清以及大部分细菌的 去除，并作为超滤、反渗透过 程的前处理。
• 可以抑制血栓的形成 • 缺点是对于已经形成的血栓没有溶解作用，并会出现血小板减少和 出血的症状
• 此种方法发展很快 • 但相关器械的安全有效性还没有得到公认，而且操作复杂，费用高
• 有对设备要求高，操作繁琐，独自使用效果差等缺点
• 主要治疗方法是通过注射给药或者直接服用，进而可以激活纤溶酶 原或是直接降解纤维蛋白来起作用。 • 优点是：操作简便、经济，治疗效果好，与服用抗凝剂相比，死亡 率显著降低，并且不形成创伤，不需要复杂的设备。
超滤是以微孔滤膜为过滤介质， 在常温下，依靠一定 的压力和流 速，使药液流经膜面，迫使低分 子物质透膜，高分子杂质被截留。 超滤膜能截留分子量在上千至数 十万的大分子，除能完成微滤的 除颗粒、除菌和澄清 作用外，还 能除去微滤膜不能除去的病菌和 热原、胶 体、蛋白等大分子化合 物，主要用于物体的分离提纯和 浓缩。
由于各种酶的生产条件不同，发酵液的 情况千变万化，当仅靠清洗无法恢复到 初始值时，就需进行必要的化学清洗。 含酶洗涤剂、碱性或酸性氧化物承溶 液体系进行复合清洗 → 离子型、中性等表面活性剂增强洗 涤效果。
展望 —— 溶栓酶方面
溶栓酶发展的必要性：
1. 广阔的医药市场
全世界血栓患者1600多万人，潜在的溶栓剂市场30亿美元。
PART
THREE
01
除枯草杆菌溶栓酶外，目前微生物酶制剂的开发十分 迅速，在国外已有四五十种，广泛应用于食品加工、医 疗诊断、饲料、皮革、化工产品和生化分析等行业。 酶发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余 的固体培养基成分，要得到澄清的酶液，必须进行过滤。 该过程的传统工艺是采用先絮凝后经板框压滤。 由于间歇发酵过程，每批酶发酵液的性质不尽相同， 因而絮凝剂的加入量很难掌握，稍不合适就会影响絮凝 质量，给板框压滤或后段酶清液的浓缩带来困难。
枯草杆菌溶栓酶的介绍 及其生产工艺
生物工程下游技术第六小组 谭月桃 姚文琼 卞婧 袁慧敏 梁灏晴
2018.6.20
C o n t e n t s
01
背景前言
02
溶栓酶 基本介绍
03
膜分离技术
04
其他生产工艺方法
05
展望
PART
ONE
全世界每年约有 2600万人因 血栓类疾病死亡
我国心脑血管疾病死亡 人数占因病死亡总人数 的40.7％，居死因之首
周海等以赤子爱胜蚓 （Eisenia foelide）为原料，经过匀浆抽提、硫酸铵分段盐 析、色谱分离、电泳等技术对LK进行了分离纯化，最后得到 LK 样品比活力为5100U/
mg，纯化倍数为1408倍，得率34.1％。
2. 基因工程技术
主要通过异源表达系统，对目标酶的基因序列进行克隆，进而转化到表达系统中重组表达。 实例：
2. 新一代抗栓药物
枯草杆菌生产的溶栓酶，具有酶活力高、作用时间长、价格低廉、
安全无毒等优点，可制成服用方便的溶栓酶口服制剂，或制成纯制剂以
静脉滴入。
35 %
3. 临床问题
进行临床治疗使用的药物大多为溶栓酶原激活剂类，仍存在半衰期 短、成本高等问题。
展望 —— 天然溶栓药物（未来溶栓药物研究的重点）
膜分离技术的影响因素：膜材料、膜组件、膜的恢复和再生
原因
一般方法
变化
01 膜表面上形成污垢
02 自来水
03 化学清洗
由于膜表面上污垢的形成 ，膜渗透能力迅速下降， 膜分离性能恶化，因此在 使用一段时间以后，必须 进行有效地恢复再生。
自来水减压清洗5 min~20 min → 浸泡4h 以上 → 减压清洗5min 左右 → 膜通量可以基本恢复到原始的 80% ~ 90%。
膜材料的比较
常用酶制剂的分子质量在10000 Da～100000 Da之间，这个范围恰 好在超滤技术应用的范围之内，采用超滤技术将粗酶液进行处理， 低分子物质和盐类可以与水一起经膜孔除去，而酶被浓缩和精制。 常用于超滤酶制剂的的膜材料为醋酸纤维素(CA)、聚丙烯腈 (PAN)、聚矾(PSF)、聚酰胺(PA)、聚偏氟乙烯(PVDF)等。 国内目前较为成熟的板式膜以CA、PS、SPS、PAN、 PAN～ PVC等为主。 中空膜以PS为主，PAN有一定生产。 总体来讲，CA膜孔径容易控制，适用于大部分的酶制剂，但物 理化学性质较差，极易为微生物“消化”。PS膜的主要特点是透 水量小，持续衰减快。PAN膜有着较好的亲水性，纯水和酶液透 过量较大。PAN—PVC膜的性 能较PAN膜更优，但都不如PS膜耐 高温、耐酸碱。SPS 膜是在聚砜共沸物基础上添加了带亲水性基 团-SO3H的磺化聚砜，使砜类膜的纯水及酶液透过性能得以较大 改善，因其成本较高，使推广应用受到了限制。
３. 发酵法
50年代以来酶生产的主要方法——利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。 发酵法可分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和固定化原生质体发酵四种。 因液体深层发酵法的机械化程度高，技术管理较严，酶产率较高，质量较好，产品回收率较高，故 成为了目前发酵生产的主要方式。
常见的血栓类疾病类型: 脑血栓栓塞、肺静脉栓塞、心 腔附壁血栓、外周动脉血栓、 缺血性休克等。
血栓的形成有多种因素，如： 血管壁的损伤、血液流速的改变、 血小板异常、促凝物质增多、抗 凝功能减弱、纤维蛋白溶解系统 受到破坏，以及血液中脂肪酸过 高
手术疗法 长期服用抗凝剂 介入疗法 超声疗法
• 主要方法是通过物理方式来清除血栓或切除血栓所在的部位 • 缺点是：操作繁琐、费用高、有创伤和易复发
如溶栓酶中的链激酶是从溶血链球菌的培养液中获得的，以及纳豆激酶和豆豉溶栓酶均是利用液体
发酵来生产的。
４. 化学合成法
60年代中期出现的新技术。 缺陷：酶的化学合成要求作为单体底物的各种氨基酸达到很高的纯度，合成的 成本高昂，也只能合成那些已搞清楚其化学结构的酶，停留在实验室阶段。
PART
Five
展望 —— 生产工艺方面
B
超滤过程中出现的浓差极化
几种常见的超滤膜组件
板框式 卷式 中空式 膜管式
A B
板框式超滤组件出现最早，且技术最成熟，具有安装、清洗及膜面检漏较为方便，
维护费用较低等优点，只是设备一次投入较大。
中空式超滤器在膜组件中有较高的比超滤面积，但对酶液的预处 理要求较高。
中空组件目前以PS膜居多，使它的优越性受到一定遏制。
（1）纤溶酶t-PA Goojani等基于根瘤农杆菌转化系统将3个嵌合重组质粒转化到烟草植物中， 并使用Southern印迹分析 来测定转化到每个转基因植物中的相应基因 (t-PA) 的拷贝数。结果检测到来自上述所有3种转化体的一个或 多个拷贝， 继而使其在宿主中表达， 得到重组表达的rt-PA。
（2）CTB-LK Guan等构建了霍乱毒素B亚基-蚓激酶 (CTB-LK) 融合基因， 并转化到向日葵种子中表达。 通过蛋白质印迹分析， 纤维蛋白平板测定和GM1神经节苷脂证实， 转基因向日葵种子中的重组蛋白 存在溶栓活性。同时， 血栓模型显示， 口服具有CTB-LK表达的转基因向日葵种子具有显著的抗血栓作用。 由于CTB-LK融合蛋白被设计用于口服给药， 因此在可食用向日葵种子中CTB-LK的表达省去了对蛋 白质的下游加工， 更利于药物的生产。
溶栓酶具有促进体内纤维蛋白溶解系统的活力，使纤维蛋白溶酶原转变为活
性的纤维蛋白溶酶，引进血栓内部崩解和血栓表面溶解。
在临床上，用于血栓性疾病治疗。
尿激酶 组织纤溶酶原激活剂
人体
蝮蛇抗栓酶 蚓激酶
动物
微生物 微生物
钠豆激酶 芽孢杆菌、粪链球菌、 链酶菌等的纤溶活性物质
溶栓酶的溶栓机制
人体内溶栓机制依赖溶栓系统， 即利用激活纤溶酶原 (Plasminogen) 形成纤溶酶 (Plasmin) ， 降解纤维蛋白， 溶栓酶的溶栓机制与体内溶栓机制相同。 溶栓系统成分有组织型溶栓酶原激活剂 (tPA) 、单链尿激酶溶栓酶原激活剂 (Single chain urokinase type plasminogen， scu-PA) 、Pg、Pm及溶栓抑制物 (α2-AP、羟脯氨酸糖蛋白等) 。
某种醋酸纤维超滤薄膜
膜材料的选择
酶本身是一种蛋白质，也可以说是一种两性离解 的电解质，在水溶液中为亲水胶体。 成膜物质特别是聚砜与酶之间的静电力、氢键、 疏水作用及荷电转移极易使酶为膜面吸附，造成超 滤吸附阻力增加，使酶液通量下降。
A
采用改变流速、扩散系数、流体黏度、 浓度与温度、 离子强度及添加适当缓冲因子等措施都可使膜通量有所 回升。 工程实际操作中常采取提高酶液沿膜面剪切速率以减 小酶于膜面处浓差极化和膜面吸附。 此外，针对所需分 离酶的化学性质选择适的高分子材质膜也极为重要。 工程上一般选用亲水性膜，疏水性膜可用化学改性、 预涂覆技术以改善其使用效果。
例如： 用基因突变的方法对现有溶栓剂进行改建； 将两种溶栓剂分子的功能区连接起来形成嵌合分子； 把纤维蛋白或者血小板的抗体和溶栓药物融合起来使其具有 导向性，以加快血栓的溶解速度，争取时间抢救患者 ……………… 但是这些还处于实验室研究阶段。
PART
TWO
链激酶(Streptokinase，SK)是世界上最早发现的纤维蛋白酶原激活 剂，也是最早作为临床药品治疗血栓性疾病的溶栓酶。
C
D
管式组件对酶液的预处理要求不太严格，亦较易清洗，为其最大优点。
我国最早在无锡酶制剂厂得以应用。
卷式组件近几年发展较为迅速，相继得以应用。
在应用方面，4种形式各具特色。 中空纤维和卷式组件多用于水处理及低黏度、低污染物料的分离； 管式和平板式组件可以采用较高的表面流速(>2 m/s)，则多用于中、高黏度和中、高污染物料的分离。 目前应用较多的是装有醋酸纤维素超滤膜的管式和薄层流道的平板式膜分离器， 对于量少或浊度与黏度不大的还可采用中空纤维膜或卷式装置。
PART
Four
1. 直接提取法
采用各种提取、分离技术，从原材料（陆生微生物、植物、动物及海洋生物） 中分离纯化出目的酶的方法。
利：简单方便
弊：必须首先获得含酶组织或细胞，这就使该法受到气候、地理环境的影响， 或在培养微生物细胞后，再从细胞中提取，而使工艺路线变得繁杂，而且产品含杂质
较多，分离纯化较困难。