三维细胞培养技术培训

3 水凝胶三维细胞培养
试剂盒组分 ① BD Matrigel ② PBS缓冲液 ③ 细胞回收液
赛哲生物®水凝胶三维细胞培养系列试剂盒（#SZCE13001~#SZCE13010） 乳腺癌系列、胃癌系列、宫颈癌系列、肝癌系列、肺癌系列 分别用于胶上培养、胶内培养
3 水凝胶三维细胞培养
胶内培养
胶上培养
2 如何实现三维细胞培养
磁力悬浮三维培养：
美国莱斯大学和德克萨斯大学M.D. Anderson 癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器 （bioassembler）。这个系统使用磁力让细胞悬浮， 并促使细胞生长成三维的形状。尤其适于培养肝脏 和心脏这种细胞密度比较大的实体器官。
文章发表在2013年3月14日的 《Nature Nanotechnology》上
水凝胶三维细胞培养
主讲人：赛哲生物 曾宏彬
广州赛哲生物科技有限公司 服务热线：400-888-4242
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① 什么是三维细胞培养 ② 如何实现三维细胞培养 ③ 水凝胶三维细胞培养 ④ 更多问题
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1 什么是三维细胞培养
——Kenneth M. Yamada, and Edna Cukierman. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. [J]cell. 130, 601-610.
一般用于软骨细胞、骨细胞的三维培养，血管形成试验等。
3 水凝胶三维细胞培养
Collagen I
美国布朗大学的生物工程师 Jeffrey Morgan 利用琼脂糖开发 出一种细胞三维培养皿。
将融化的琼脂糖制成微型培养板 （ micro-moulds ） ， 等 琼 脂 糖 凝 固 之后，再将这种琼脂糖材料放置到普 通的培养板里。再在培养板里加入细 胞和培养基，由于重力的作用，细胞 会沉积到琼脂糖培养板里，彼此聚集 在一起，形成球形的多细胞团块。
2ml离心管中，置于冰上融解约30min，每隔5-10min来回颠倒一次，待 观察到细胞团可顺利沉至管底部，4 ℃，3000rpm离心5min，收集细胞。
优点：细胞可保持在胶内的形态，不含酶，对细胞伤害小。 缺点：凝胶去除不彻底，有可能影响到后续检测。
3 水凝胶三维细胞培养
细胞的回收
酶消化：
胰酶（0.25%） 1-2ml 酶液，置于37 ℃消化15-30min，待观察到细胞团逐渐散开，3000rpm
铺胶
接种细胞
培养
收集细胞 Or
观察与检测
3 水凝胶三维细胞培养
铺胶
胶上培养：薄胶（ 30~50 μL/cm2），形成约0.5 mm厚度的凝胶
胶内培养：薄胶（可选）+厚胶（100~200 μL/cm2），形成大于1 mm厚 度的厚胶
操作步骤： 铺胶前的准备：
Matrigel 置于冰上融解； 使用到的所有器材（吸头、小管、培养板）须冰预冷。 铺胶： 薄胶：用冰预冷的吸头吸取60~100μL 液态的Matrigel，均匀涂抹孔 板底部，使其厚度均匀，避免产生气泡；在37℃放置30分钟，即可成胶。
离心5min，收集细胞。 优点：凝胶去除较彻底 缺点：对细胞伤害较大，继续培养效果差
分散酶（dispase） 1-2ml 酶液，置于37 ℃消化2 hours，待观察到细胞团逐渐散开，3000rpm离
心5min，收集细胞。 优点：凝胶去除较彻底，对细胞伤害小，可继续培养 缺点：耗时长、价格高
3 水凝胶三维细胞培养
建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之 间的鸿沟。通过模仿体内环境的特性，并利用传统的细胞培养研究工 具，三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为、组织器官 和肿瘤的发展过程。这些研究模型有利于加速癌症生物学和组织工程 领域的转化研究。
1 什么是三维细胞培养
3D
2D
VS
2 如何实现三维细胞培养
在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结 构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化 功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺 细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达， 支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内 血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。
2 如何实现三维细胞培养
水凝胶三维培养：
将细胞培植在一定的细胞外基质中 , 细胞外基质（extracellularmatrix, ECM） 蛋白充当生长支架。
3 水凝胶三维细胞培养
Matrigel Collagen I Agarose
3 水凝胶三维细胞培养
Matrigel
从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel 基 底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝 素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。
CD24
GAPDH
C
CD44
CD24
3 水凝胶三维细胞培养
案例分析
内容内容
4 更多问题
Any Question ?
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3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
免疫荧光观察蛋白定位
Confocal Fluorescence Microscopy
S1 cell
T4-2 cell CAR
E-Cadherin
3 水凝胶三维细胞培养
赛哲乳腺癌肿瘤干细胞筛选试剂盒——专利产品
试剂盒组分 ① Salmon fibringen ② Salmon thromin ③ PBS缓冲液 ④ 酶消化液
水凝胶
固体支架
磁力悬浮
2 如何实现三维细胞培养
固体支架三维培养：
组织工程支架作为组织工程的平台，不仅提供了细胞生长的框架，使之形成特 定的组织或器官形状；而且作为细胞外基质成分之一，是细胞间信号传导和相互作 用的媒介，同时也是细胞生长所必需的生物活性剂。
目前用于组织工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯、聚偶磷 氮、聚酸酐等。其中研究最多的是脂肪族聚酯，特别是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸 （PGA）及其共聚物等。
采用Salmon fibringen在 Salmon thromin的作用下，形成血纤蛋白凝胶。通过 调节纤维蛋白原的浓度使形成的水凝胶的硬度在80～100pa范围内，使乳腺癌干细胞 能够在基质中增殖，并维持其自我更新的特性，从而筛选获得肿瘤干细胞微球。
3 水凝胶三维细胞培养
A
B
筛选后 筛选前
D
CD44
3 水凝胶三维细胞培养
接种和培养
胶上培养：制备细胞悬液，以合适的密度接种于薄胶上，即可进行培养； 胶内培养：制备细胞悬液，调整至合适的细胞密度，取 100~200 μL 与 Matrigel 等比例混合均匀，接种于孔板中，在37℃放置30分钟，成胶后， 在胶面上轻轻加入完全培养基即可进行培养。
TIPS： 一般用于肿瘤微球形成、侵袭等观察，接种密度应控制在2000 -3000 cells /孔； 观察血管形成接种密度需达到105 cells /孔。
3 水凝胶三维细胞培养
细胞处理
药物刺激： 胶上层培养液中加入刺激药物
细胞转染： 胶上培养： ① 使用sagene 3D-HG（#SC1201） 三维培养专用转染试剂 ② 使用慢病毒or 腺病毒感染 胶内培养： 使用慢病毒or 腺病毒感染
3 水凝胶三维细胞培养
细胞的回收
细胞回收液（cell recovery solution）：不含酶，能够解聚matrigel 1-2ml 细 胞 回 收 液 ， 轻 轻 刮 起 含 有 细 胞 的 凝 胶 （ 禁 止 吹 吸 ） ， 转 入
观察与检测
形态观察 ：
乳腺上皮细胞MCF-10A细胞形成的乳腺腺泡结构
前列腺癌细胞PC3的侵袭性观察
3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
实时荧光定量PCR检测 mRNA、miRNA 抽提RNA： 不需要除去凝胶，可直接加入trizol or bioopure，抽提RNA；
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样品编号 1 2 3 4
260/280 2.07 2.04 2.11 2.06
Conc. (ng/ul) 2068 1802.2 1660.8 1267.4
1：不去胶 2：不去胶 3：去胶 4：去胶
Amplification plot of Actin
3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
Western blot检测蛋白 若检测大分子蛋白，一定要除去
凝胶，回收细胞后提取蛋白 细胞回收液或酶消化均可
不去胶 去胶
GAPDH
3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
细胞增殖检测（MTT法） 不需要除去凝胶，可直接加入
MTT孵育 一定要设不含细胞，只含有凝
胶的空白对照孔
3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
免疫荧光观察蛋白定位 胶上培养：可直接固定、孵育抗体等操作 胶内培养：需回收细胞 采用细胞回收液回收细胞，维持细胞团结构，重新接种于圆形盖
3 水凝胶三维细胞培养
Agarose
I型胶原在大部分组织中都有分布，尤其在骨组织、肌腱以及 真皮组织中含量极其丰富。I型胶原一般是分离自大鼠尾中，也常 被称为鼠尾胶。
在酸性条件下成液态，一般保存于醋酸溶液中。使用时，需用PBS稀释成合适的 浓度（大于1 mg/ml），并用氢氧化钠调节PH值至7.2-7.4，可聚合形成具有生物学活 性的三维基质。
玻片上，使细胞贴附于玻片上，再进行固定、抗体孵育等步骤
TIPS： 抗体孵育或染色后，洗涤次数需增加，时间最好延长至15min 若需进行激光共聚焦观察，可直接在厚度为0.13-0.17mm圆形盖 玻片上铺胶接种细胞
3 水凝胶三维细胞培养
观察与检测
免疫荧光观察蛋白定位
不去胶
去胶
DAPI
β-tublin