第四章 聚合酶链式反应

程便可克隆tRNA基因。

但由于测序和引物合成的困难，
以及70年代基因工程技术的发明
使克隆基因成为可能，所以，
Khorana的设想被人们遗忘了…
4.1 PCR技术简史

1985年，美国PE-Cetus公司Mullis等 人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的

DNA复制

最 初 采 用 E-coli DNA 聚 合 酶 I 的
Klenow片段进行PCR，
4.1 PCR技术简史

1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌中提
取到一种耐热-Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能
高效率的进行，PE-Cetus公司推出
了第一台PCR自动化热循环仪。

1993年，Mullis因此项技术获诺贝
尔化学奖
94℃
55℃
② 最适温度高 最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb ③ Taq酶的功能缺点
具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活 性，但没有3‘5’外切酶活性。
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现 错配，用于克隆基因时必须测序。
④ Taq DNA聚合酶的激活剂
3’
3’
②引物的长度
理论计算：
419=2.751011。
即2.751011 bp的基因组中有一次 完全与19个核苷酸的序列相同的 机会（或机会是约2×10-11）。
一般引物设计为长15—30bp。
③引物的碱基序列
3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
③竞争引物PCR ： 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条 件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物 才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段 上是否带有某一已知碱基置换。
准确配对引物 错配引物 模板 共同引物
or
模板
or
PCR
or
④不对称PCR
用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键： 两个引物的浓度相差100倍。 3’ 5’ 5’
⑥ 反向PCR：
扩增两个引物外侧的未知序列 3’
5’
template template
5’ 3’
（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。
技术关键：
把线性DNA模板转变成环形分子。
使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。
⑦兼并引物PCR（Degenerate Primer）
兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有 不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并 度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽 量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’ 末端兼并，因为3'端最后3个碱基的退火足 以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所 有的碱基配对，降低引物的退火温度。
72℃
PCR循环
PCR仪
PCR反应
4.2 PCR反应原理
模板DNA变性
引物DNA复性 PCR
引物DNA延伸
（1）DNA模板变性
95oC
双链DNA在受热后，配对碱基的氢键 断裂，DNA两条链分开成为单链。 5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG 95oC
TGCATGCAT3’ ACGTACGTA 5’
4.6 影响 PCR的因素
（1）Taq DNA聚合酶 自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合 酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断 （37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。 ① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高 温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
选择GC含量为45％到55％碱基的分布是随机的；
避免引物间和引物内产生４碱基以上互补；
避免3‘末端的错误配对；
设计5‘端和中间区为G或C的引物；
避免引物对3‘末端存在互补序列；
避免3‘末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷
中含有3个A或T。
避免存在可能会产生内部二级结构的序列。
引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其
噬菌体启动子
蛋白质结合序列
合成RNA探针、测序
产物纯化、检测
核糖体结合序列
其它
高效表达
构建载体、重组子等
4.8
聚合酶链式反应技术类型
①巢式PCR：
是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出 第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设
计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,
不受平台效应限制,灵敏度高。
template 5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点 顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或 生物素标记等，方便与以后操作。
④引物的碱基组成
1） 尽可能提高G+C含量，以提高引物 与模板的结合力
2） 避免连续相同碱基排列或内部回文序列.
5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’
发卡结构 T CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’
3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的 连续碱基序列互补。 primer1 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer2
Sense primer vs Antisense primer Upstream primer vs Downstream primer Forward primer vs Reverse primer Primer1 vs Primer2
2
（3） dNTP
dNTP呈颗粒状，
保存不当易变性失
dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃
冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓
度过低会降低PCR产物的产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，
影响DNA聚合酶的活性
（3）DNA链的延伸
72oC
DNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。 5’ ATCTTGAAC
模板 Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
（5）1个循环的结果
（4）新一轮循环开始
变性—复性—延伸。
第四章 聚合酶链式反应 聚合酶链反应( Polymerase Chain
Reaction, PCR)是80年代中期发展起来 的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏 感、产率高、 快速、 简便、重复性好、
易自动化等突出优点。
4.1 PCR技术简史

1971年，Khorana提出： DNA经过 变性，与合适引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过
（4）模板DNA
① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的 螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。
② 模板的量： 不能太多，100l反应体系中100ng足够。
2+ （5） Mg
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的
PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
PCR反应曲线
4.3 PCR的过程
（1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链 完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal）
50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。
① 引物的浓度高， ② 引物的链短。
3’ 引物少 低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后 只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后 产物中99%是单链DNA。
⑤ 锚定PCR： 锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端 人工接上一个已知序列
片段,利用一个基因特
异引物与这个人工序列
区引物（锚定引物）进
行扩增，所以它是一种
半特异性扩增。
⑤引物的Tm值
手工计算： Tm=（G+C)4 + (A+T)2
一般估计： 当引物中的（G+C）含量低于50% 时，复性温度低于55 oC。 实际复性温度选择低于Tm值5 oC。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结 合的特异性，减少非特异产物的出现。
⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.2mol/L。 ⑦简并引物
③ 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发，
尤其是能减少引物二聚体的引发；
④ 改变Mg2+的浓度；
⑤ 引物设计的特异性； ⑥ 减少循环次数； ⑦ 热启动（Hot Start） ⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性。
4.7 引物设计的基本原则：
典型的引物1５到30个核苷酸长 ；
如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸 序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。
需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或 几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。
⑧套嵌引物（nested primers)
设计多组引物，结合位点依次位于前一组 引物之间。增加扩增产物的特异性。 1 3
4
引物设计现在多用专业软件 如Primer5.0等
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定 或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
（5）可以扩增mRNA
RT-PCR： 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA， 再以cDNA为模板进行扩增。
4.5 标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至 10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul
（3）第三步
延伸（extend）
72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶 在引物的3‘端上加上核苷酸。 （4）第四步 变性（denature）
94 oC下1分钟，新合成的DNA双 链又变性成单链模板。
（5）第五步
重复（repeat）
温度循环
95oC 5min 第二步——第三步——第四步 94oC 1min 72oC 2min 50oC 1min 复性 变性
金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-
0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是
2.0mmol/L。
50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
（2）引物（primer)
①位置
与待扩增的模板DNA区段的两3’端 序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。
延伸
4.4 PCR的特点
（1）特异性强 ① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延 伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 （2）敏感性高
需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
（3）快速 整个PCR过程约4小时即可完成。 （4）简便 对模板的纯度要求低。
它序列无明显同源性
引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两 个外显子 附加序列:目的序列上并不存在的附加序列， 如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5’ 端而不影响特异性。
引物5′端修饰技术
修 饰 法 用 途
附加核酸序列：
酶切位点 克隆（如定向克隆）
② 降落PCR
选定一个温度范围，如50——35，每个温度2 循环，然后在35度15循环。其原理是，随着退 火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条 带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超 过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异 性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围
较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。
5’ ATCTTGAAC
模板
TGCATGCAT 3’
3’ TAGAACTTG ACGTACGTA 5’ 模板（template）
（2）DNA模板与引物复性 引物（primer）:
40-65oC
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与 所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。 模板 5’ ATCTTGAAC TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’ 引物 引物 5’ ATCTTGAAC 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ TAGAACTTG 模板
Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特
异扩ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的
活性，使反应产物减少
4.7 提高PCR扩增的特异性
① 一定范围内提高退火温度； ② 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及
多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会；