组合生物学ppt课件

三、组合生物合成中常用的 生物技术
1.抗性基因作为探针 由于抗性基因的克隆相对直接，以抗 性基因为探针，通过染色体步移克隆其 他结构基因和调节基因
2.“反向遗传学”法 这种方法是通过分离纯化代谢途径中 催化某一步反应的相关酶蛋白，经蛋白序 列分析后获得其中的一段氨基酸序列，以 此为模板设计简单并性寡核苷酸作为探针 进行基因文库的筛选
组合生物合成的研究原理图 Figure 1 Principle and strategy of combinatorial biosynthesis
（二）、组合生物合成的特点
• 天然产物的生物合成是由一系列的酶系作介导，由低级代 谢物作为起始物，经过一系列反应最终合成末端产物。组 合生物合成是通过操纵天然化合物合成途径中的基因产生 天然的天然同系物。 • 生物合成较之传统化学合成的主要优点在于环保，化学的 选择性和分子的多样性方面，生物合成的优势是酶有足够 的精确性修饰特点的位点，而不会导致副产物的产生，可 以改变那些化学方法所不能改变的分子基因
3.突变株互补法 主要是把野生型产生菌的DNA克隆到 有遗传诱变获得的突变株中，通过测定突 变株中填入产物的生产是否被恢复判断克 隆到的DNA是否与其生物合成有关，是一 种早期方法。
4.PCR扩增： 是根据同源基因的保守序列设计简单 性引导物，运用PCR扩增，从填入产物产 生菌中克隆生物合成基因，是目前普遍采 用的方法。 还有转座子中断克隆、同源基因作为探 针、异源表达克隆等。
这一步是操作重点，不同AT域识别不同的 延伸单位，所以相互代替或置换AT域可以产生 新的化合物
5）β-碳链延伸域修饰的操作： 形成产物的多样性 6）单元连接序列的操作
以上这些可以是单个单元的操作，也可是两个、三 个单元分别改变后的组合操作。
7）对聚酮体进行后修饰：
包括糖苷化与羟基化，修饰后才具有生 物活性
组合生物学
一、组合生物合成简介
（一）、组合生物合成的概念
• 指在了解微生物生物合成途径以及克隆有关生物 合成、调节等基因的基础上，在体外对这些不同 来源（种内或种外）的基因进行删除、添加、取 代以及重组，然后导入到一个适当的微生物宿主 中并定向合成所需的一系列化合物，例如新抗生 素或其他一些新的生理活性物质。它与组合化学 的主要区别是在基因水平上由微生物合成各种各 样的化合物。 • 它是利用天然产物生物合成机制获得大量新的 “非天然”天然产物的方法。
二、组合生物合成法
（一）组合生物合成的基本程序：
【1】组合生物合成的基因操作
【2】组合生物合成的表达体系 【3】克隆生物合成的功能基因簇
【1】基因操作
• 组合生物合成的关键在于利用微生物体 内的DNA重组技术对催化新型化学结构 的蛋白质编码基因的遗传操作，可分为 PKSI型基因的组合操作和PKSII型基因 的组合操作
四、聚酮类化合物及其组合生物合成
1、聚酮化合物及聚酮化合物酶
• 聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级 羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物，它包 括许许多多具有抑制细菌(如红霉素、四环素)、 真菌(如灰黄霉素、两性霉素)、寄生虫(如 avermectin、奈马克丁)、癌症(如多柔比星、 enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化 合物同时还具有免疫抑制剂的活性(如雷帕霉素、 FK506)，它被广泛地应用于医药、畜牧和农业。
组合生物合成的主要特点：
1.组合生物合成可以产生大量化合物，可轻易产生许多类似物，可以将 同一系列的化合物“一网打尽”。 2.应用组合生物合成可以改变抗药生物原有的生物合成过程，使其结构 多样化。因此随着这一研究方法的不断发展，进一步理解一些重要次 级代谢产物的结构和功能的关系，将能够合成更多抗酸且对耐药性致 病菌具有活性的新的红霉素类物质，从而使更安全有效的药物不断出 现。 3.对一些现有结构复杂的天然产物的优先成分进行定向合成或者对临床 用抗生素品种进行有针对性的修饰和改造，如青蒿素，银杏内酯。例 如：对红霉素进行改造产生酮内酶型的大环内酯类抗生素，从而获得 对临床耐药性能有明显改善的天然产物或抗生素。 4.多基因组合操作的平台是以易于大规模生产的微生物体系为基础，使 创新型药物的研究更易产业化。
【3】克隆生物合成的功能基因簇
• 生物合成功能基因簇的克隆始于对一种链 霉菌的菌株DNA随机片段的克隆。对生产 特定抗生素的菌株，通过克隆使其成为突 变株，使抗生素的生物合成停滞在整个生 物合成途径中的某一步，常用的克隆生物 合成基因的方法有：将目的基因克隆到标 准宿主菌种，然后个别产物检测，克隆与 阻断突变株互补的基因等
1）整个单元操作改变聚酮体链的长度：
PKSI中结构单个ORF可以单独表达， 去掉特定的ORF可以改变链长。
2）替代LD改变生物合成起始单位： LD区域是PKS基因簇的操作靶点，用异源 LD域替代原LD域可以改变所接受的起始单元， 获得新的聚酮体。
3）前体定向生物合成：
由新的前提介导生物合成称前体定向生合 成。 4）AT域的互换 ：
8）体外表达ห้องสมุดไป่ตู้统：
现已发展了体外表达DERS蛋白系统
2.PKSII型组合生物合成的基因操作
•
图2
Ⅱ型PKSs 的结构 minimal PKS 包括酮基合成酶(KS) , 酰基载体蛋白(ACP) , 链长 因子(CLF) , 酰基转移酶(AT) ,酮基还原酶(KR) ,芳香化酶(ARO) ,环化酶 (CY
• 芳香族聚酮体，PKSII型基因作用机制研究还和不够，在 这里不做介绍
【3】组合生物合成的表达系统
载体系统： 理想的载体应具备稳定的复制子和选择 性标记。 宿主系统： 理想的宿主系统应是遗传学背景比较清楚， 使重组DNA可以轻易导入、回收和保持， 外源基因应能在其中充分表达及准确折叠 和进行翻译后加工
1.PKSI型基因的组合操作
Ⅰ型PKSs 的结构 62dEB 聚合酶由DEBS1 ,2 和3 组成,每个DEBS 由两个组块组成,每个组 块包含有催化缩合的活性亚基;酰基转移酶(AT) α , β , 2酮酰基载体蛋白 合成酶(KS)和酰基载体蛋白(ACP) ,同时有还原性活性亚基[β 2酮基还原酶 (KR) ,脱水酶(DH) 和烯酰还原酶(ER) ] 。反应完成后,硫酯酶(TE) 负责聚 酮链从酶上解离