石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
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石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存:
采取组织后,
方法一:4%多聚甲醛(4%PFA)4 C固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固
定时间)或过夜
方法二:采用bouin '固定RT 2h(6-8d tesis)or RT 过夜(成年tesis)
PBS缓冲液洗三次,每次5min , 4 C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存::
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54 C石蜡包埋,常规切片,切片厚
4 -10 ^m,贴于处理过的干净载玻片上,37 C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。
石蜡包埋:
保存于4C 70%乙醇中的组织样品
80% 乙醇15 min
95% 乙醇15 min
100% 乙醇15mi n 2
1/2乙醇1/2二甲苯15 min
-
二甲苯透明5-10 min
1/2二甲苯1/2石蜡30 min
石蜡(1) 1.5hr
石蜡(2) 1.5-2.5hr
石蜡(3)包埋
RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法:
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯(2)20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡5 min*2
0.4%Trit onx RT 10 min
I
切片在PBS中浸泡5 min*3
3%H2O2 RT 10mi n
切片在PBS中浸泡5 min*3
0.25% 胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 mi n*3
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trito nx-100 in PBS) RT 6 0min
倾去blocking buffer ,勿洗
一抗4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡5 min*3
I
二抗in blocking buffer GAR1 : 200 (GAM1 100), RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB 显色5-10min( 50 微升A+50 微升B+900 微升PBS+5 微升3%H2O2 )
如果是增强型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS终止显色,HE衬染1s,
玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深,可用0.1-0.5%盐酸乙
醇分色1〜2秒钟(或更久)
I
脱水85%乙醇5 min
95% 乙醇5 min
无水乙醇 5 min
无水乙醇5mi n
二甲苯⑴ 10min
二甲苯(2) 10min
中性树胶封片,室温干燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法:
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯(2) 20 min
100% 乙醇20min
95% 乙醇10 min
80% 乙醇10 min
通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡5 min*2
0.4%Trit onx RT 10 min
切片在PBS中浸泡5 min*3
切片在PBS 5 mi
n*3
0.25% RT 10min
切片在PBS 5 mi
n*3
Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trit on x-100 in PBS)
倾去 blocking buffer ,勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h ,切片在PBS 中浸泡 5 min*3
I
荧光二抗 in blocking buffer GAR-cy3 1: 1000, GAM-4881:
切片在PBS 中浸泡 5 min*3
I
moil 封片,避光4 C 保存
RT 6 0min
1000RT1h