流式细胞术(FlowCytometry,FCM)描述

荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
流式常见图形 (Histogram Plot)
适用于：单参数分析
流式常见图形 (Dot Plot)
适用于：多参数分析
第二节 流式细胞术的科研应用
分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量
流式应用常见范围
细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
流式细胞仪结构
百度文库• 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 • 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 • 存储、显示、分析系统：计算机。 • 细胞分选系统
流式免疫分型技术要点
流式细胞术 （Flow Cytometry,FCM)
作者：笛风
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
S
G1
G0 Quiescent cells
FCM应用
1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 2、凋亡检测 3、免疫功能的检测 4、血液学应用 5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。 6、其他：溶液中细胞因子的测量。 7、细胞分选
细胞增殖周期测定和DNA倍体分析
1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期 内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4倍 体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和 蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。 细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色 体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C 。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静 止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周 期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正 态分布。
细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining
Caspases
Annexin V Assay建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡
流式“TUNEL”
Intracellular Cytokine-Protocol
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
Traditional Analysis -- Percent positive
抗体标记的方法
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适
合弱抗原的检测
实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参 数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
Linear Fluorescence in FL2
10000
1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
10
cell and bead neg
1
10 2
103
104
10
5
Molecules PE per Bead