适配体

核酸适配体概况及应用研究进展
王慧
摘要：适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸，其可形成的特殊的立体结构以辨识特定的蛋白质，具有疾病诊断与治疗的应用的潜力。

适配体的产生是借由一种称为SELEX法德人工筛选程序。

适配体在分析化学,在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及基因调控等领域已经成为重要的研究工具，本文就适配体的主要应用进行综述。

关键词：适配体筛选应用综述
Abstract: “Aptamers” is a unique class of single-stranded oligonucleotides that resemble naturally occurring antibodies.They can fold into unique tertiary conformations for specific recognition of target proteins. Thus, aptamers have great potential for disease diagnosis and therapy. Aptamer is a important research tool of study proteomics,clinical medicine and so on. This review describes the current status and discusses the application of aptamer .
Key words:apeamer selection application
前言
适配体是指利用指数富集的配体进化技术(system aticevolution of ligands by exponential enrichment SELEX)从特定的寡核苷酸库中筛选出能与靶分子特异性结合寡核苷酸(DNA或RNA)。

至今已经筛选出300种以上能够与目标分子结合的适配体,这些目标分子包括酶、生长因子、抗体、转录因子、核苷酸、多肽、抗生素、氨基酸、有机染料以及重金属离子等[1],甚至完整的病毒和病原体以及完整的细胞[2-3]。

其解离常数高于其它类型的配基。

1、适配体的特点
适配体具有与抗体相类似的性质,但是在许多方面还体现出了优于抗体的特点: (1) 特异性更强，对目标靶分子的亲和性比抗体更高; (2) 适配体较抗体更容易获得(可人工合成,不依赖于动物和细胞）,并且可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;(3)可以针对不同种类的目标靶分子进行筛选,包括生物毒性分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;（4）无免疫原性，可在体内反复使用； (5)稳定性优于抗体,利于储存。

随着适配体技术的不断进步,适配体在许多领域将有可能成为抗体技术有益的补充。

正是基于适配体的各种优点,适配体在分析、临床、环境、分子识别及药物筛选等方面都显示出了广阔的应用前景[4-6]。

2、适配体的两种主要类型
反义核苷酸链通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与它们的靶序列是互补的。

随机核苷酸链随机核苷酸链是在反义核苷酸链的作用基础上发展来的。

随机核苷酸链作用的靶除了核酸外还可以是蛋白质、有机小分子等。

随机核苷酸链一般比反义核苷酸链要长,而且它们折叠形成的空间结构也往往发挥作用。

3、适配体技术的理论基础
SELEX技术的基本原理是利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用,从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸并结合体外PCR扩增技术,使其得到指数级富集,如此循环数轮最终进化成为高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。

SELEX技术大致可以分为以下几步:
①建立寡核苷酸库。

②适配体的筛选、分离和扩增。

③适配体的修饰。

4、适配体SELEX筛选技术
4.1膜介质SELEX筛选技术
膜介质SELEX筛选技术方法比较常用的是以硝酸纤维素膜为介质的筛选方法[16]。

此方法是将寡核苷酸文库与靶分子充分反应后通过事先润湿的硝酸纤维素膜后,与靶分子结合的寡核苷酸序列留在滤膜上,而未结合的序列则可以通过滤膜。

结合在膜上的寡核苷酸洗脱后
经过PCR扩增后作为新的文库进行下一轮筛选,直到获得与靶分子具有高亲和力的寡核苷酸序列。

至今,它仍被认为是进行适配体筛选的最快速有效的方法之一,有许多靶分子的适配体就是通过该方法获得的。

4.2亲和介质
一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选,如琼脂糖、纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。

利用这些亲和介质可以筛选一些小分子物质,如染料、金属、毒素的适配体。

4.3 CE-SELEX
在众多改进的适配体筛选方法中,发展较快的是以毛细管电泳为基础的SELEX技术(CE-SELEX),该方法最显著的特点是整个筛选过程只需要4个循环，仅需2-4d就可以完成。

5、适配体应用
随着筛选技术研究的发展,越来越多靶分子获得高亲和力的、高特异性的适配体,并广泛应用于多个研究领域。

与成熟的抗体实验相比,目前适配体可以补充抗体性能的不足,而不能完全取代。

5.1适配体在检测肿瘤细胞的媒介作用
适配体与抗体相比较,具有更好的组织渗透性和更快的血浆清除率,且分子量小、信噪比高、成像质量好,特别适合作为非侵入性诊断成像试剂。

例如Te-nascin-C是一种细胞外基质蛋白,这种蛋白在组织重建包括肿瘤生长的过程中过量表达,它被认为是上皮恶性肿瘤的一种间质状标记,通过检测Tena-scin-C的水平高低可以对肿瘤的复发、浸润和远处转移进行预测[12]。

用Lupold等[12]经过筛选得到针对PSMA细胞外部分的重组蛋白的两个适配体,均可特异结合表达PS-MA的前列腺癌细胞,这是首次报道与肿瘤相关膜抗原结合的RNA适配子.肿管在结构和代谢功能上与正常血管不同,新生血管与内皮细胞的表达密切相关。

这些通过筛选获得的特异识别肿瘤细胞的适配体,本身就可以在不需要知道正常细胞和肿瘤细胞之间的差异成分的情况下,直接用于肿瘤的诊断和导向治疗。

而这些适配体所特异结合的蛋白质或其它成分正是正常细胞和肿瘤细胞之间的差异成份,因此只要能够将这些差异成分进行纯化、鉴定和检测,新的分子标志物就有可能被发现,它们有可能成为新的特异性肿瘤标志物。

随着适配体筛选技术研究水平的进一步提高,适配体技术可以更加快速、灵敏、特异、自动化地进行肿瘤标志物的筛选,新的特异的肿瘤标志物的发现和更加灵敏的检测工具的发展,必将大大促进肿瘤的筛查和早期诊断,为早期发现并治愈肿瘤提供可能。

5.2核酸适配体亲和色谱
由于高的亲和力和特异性,免疫抗体是亲和色谱中应用最广的亲和配体, 1996年,Drolet小组[7]首先报道了将核酸适配体亲和色谱用于提纯蛋白质L-选择素(L-selectin)。

随后,核酸适配体亲和色谱的应用领域逐渐拓展,已经被应用在分离和检测中得到了广泛的应用。

核酸适配体亲和色谱充分发挥了核酸适配体与亲和色谱技术的优势,已经被应用于小分子、蛋白质和细胞的分离和检测。

核酸适配体亲和色谱在制备、固相覆盖密度、储存稳定性及亲和柱再生等方面显示出了优于免疫抗体亲和色谱的特性。

目前所报道的研究中,核酸适配体亲和色谱的色谱柱包括填充色谱柱、毛细管开管柱[8-13]、毛细管高分子整体柱等。

目前常采用微型柱和毛细管柱作为色谱柱,特别是以分析检测为目的的工作,这主要是受制备成本(核酸适配体、填料等的制备)的限制。

对于以分离纯化为目的的工作(如纯化蛋白质),柱径较大的色谱柱更具有优势。

核酸适配体亲和色谱的检测方法目前主要包括紫外吸收、荧光、质谱等。

紫外检测由于简易、方便而应用得最多。

核酸适配体亲和色谱技术中应用较多的是DNA适配体[14-17]。

DNA适配体亲和色谱柱具有很好的稳定性,储存几个月甚至半年以上仍具有很好的活性。

由于稳定性差, RNA适配体的应用则较少。

核酸适配体在中性条件下带有负电荷,会与带有正电荷的物质产生非特异性的相互作用,因此核酸适配体亲和色谱柱具有阳离子交换色谱的一些性质,会对样品的分离产生影响,特别是在复杂样品的分离和检测中可能会带来一些困难和干扰。

由于核酸适配体会被核酸酶降解,因此在储存和应用中还应避免核酸酶的存在。

5.3核酸适配体微阵列晶片
适配体的产生是借由SELEX法筛选，此程序涉及大量核酸序列分析与配位子确认，应用微阵列晶片技术可以有效地缩短核酸适配体筛选程序，并且以寡核苷酸所构成的适配体点印成微阵列晶片可作为一种新颖蛋白质晶片应用[18-21]。

这类型的适配体晶片拥有核酸晶片在制造上与保存上的优点，同时又可以针对特定蛋白质目标物进行专一性侦测或对组成复杂的蛋白质样本进行分析，因此以适配体为核心的适配体晶片有机会凌驾于传统抗体式的蛋白质晶片上。

核酸适配体可以被用来检测全蛋白体中的差异性蛋白，因此便能利用这样的策略来找寻疾病的标记蛋白(disease markers)。

例如以大肠杆菌的全蛋白质进行核酸适配体的筛选来发展多通路平行化SELEX技术，作为筛选复杂蛋白基质(complex protein matrixes)核酸适配体的方法。

在策略上，首先利用不同萃取条
件以及HPLC技术，在不同浓度下获得供26组大肠杆菌全蛋白分群检体，其次，利用SELEX 技术进行筛选，利用微阵列晶片进行挑选，获得对应大肠杆菌全蛋白中各种不同蛋白质的核酸适配体。

核酸适配体微阵列晶片是一个崭新的应用领域，它可以协助核酸适配体序列的最佳化，配合不同的探针设计策略，便能针对核酸适配体中重要的辨识序列进行分析与决定。

5.4适配体在蛋白质功能研究中的应用
适配体对蛋白质的生物功能可进行直接调控。

如利用适配体结合中性粒细胞中弹性蛋白酶从而阻止其催化反应,其作用超过了此蛋白酶的天然抑制因子;而可识别凝血因子Ⅸa的RNA适配体在临床中已可替代肝素,并可通过适配体的互补序列来调控抗凝效果;亦开发出一些与肿瘤、艾滋病、肝炎相关蛋白质的适配体,用于直接干扰疾病的发展过程。

适配体可以直接在转录和翻译两个水平上对基因表达产物进行调控。

适配体通过对构成表达体系中的各类因子的作用,抑制或激活调控蛋白的活性来影响mRNA或蛋白质的表达量。

或将适配体作为调控元件插入到表达体系中,通过适配体与靶分子结合时的变构效应,影响蛋白质最终表达。

随着核酸适配体筛选技术的发展,将会有越来越多的核酸适配体被筛选出来,核酸适配体的应用也会更广阔。

进一步发展有效的固定化方法,提高制备的效率,降低制备成本,不同的检测方法耦联,将有利于核酸适配体亲和色谱技术在分离和分析中的应用及充分发挥其独特的优势。

核酸适配体亲和色谱在分离纯化和检测方面具有广阔的发展空间。

6、前景与展望
正是基于寡核苷酸适配体的高特异性、高亲和力、易体外合成及修饰等特性,寡核苷酸适配体可作为配基应用于靶分子的分离;其高特异性和高亲和力地与靶分子结合特性使其可应用于靶分子的捕获;适配体还被用作分子信标定量检测靶分子。

适配体不仅仅在分析化学,在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及基因调控等领域已经成为重要的研究工具。

随着寡核苷酸适配体的研究进展,以及在多学科之间的广泛渗透,其在许多领域将具有更广泛的应用前景[21-26]。

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