线粒体病及其分子诊断
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线粒体病及其分子诊断
欧启水
福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学医学检验系
福建医科大学基因诊断研究室
➢ 1962年Luft等首先报道了一例女性患者，其主 要表现为肌无力、极度不能耐受疲劳、多汗， 甲状腺功能正常。
➢ 经生化证实为线粒体氧化磷酸化脱偶联引起， 并被确定为线粒体肌病。从此，线粒体异常引 起的一类疾病被确定为一组独立的疾病实体－ －线粒体病。
22个tRNA和13个氧化磷酸化过 程所需要的蛋白多肽。 ➢ 线粒体基因组各基因之间 无内含子，呈紧密排列。
线粒体DNA的特点
➢ 非孟德尔的母系遗传 mtDNA为母系遗传，发生在生殖细胞系中的突变 能通过女儿传递给子代，引起母系家族性疾病；
➢ 异质性与阈值效应 线粒体几乎存在于人体的所有细胞中，有害的突变 基因常常仅影响部分mtDNA，这就使细胞、组织 中同时存在野生型DNA和突变型DNA。当 mtDNA突变数目达到某一数量时，可引起某组织 或器官的功能异常而出现临床症状，这就是阈值效 应。
实验室检查
➢ 乳酸和丙酮酸盐：空腹血乳酸盐浓度 ≥3mmol/L和空腹脑脊液乳酸盐浓度＞ 1.5mmol/L支持线粒体病的诊断，但需排除其 他导致乳酸盐增高的原因。
➢ 血浆磷酸肌酸激酶（CK）：明显增高可能见于 线粒体DNA耗竭。
➢ 此外，实验室检查应注意结合影像学、神经生 理学、心电图和病理活检等检查。
translocator，ANT）
线粒体电子传递链示意图
线粒体DNA
➢ 半自主复制的细胞器，有独立的遗传装置。 ➢ 2～10个拷贝线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）/线
粒体。 ➢ mtDNA约占细胞总DNA的1％，环状，轻重两条链互
补。 ➢ 含16569个碱基，编码2个rRNA，
➢ 半自主复制与协同作用
mtDNA虽有自我复制、转录和编码功能，但该过 程还需要数十种nDNA编码的酶参加，因此 mtDNA基因的表达同时也受nDNA的制约，两者 具有协同作用
➢ 高突变频率
线粒体编码基因排列紧凑、无间隔区且部分区域存 在重叠。因此，任何突变都会累及到基因组中的 重要功能区域。同时，mtDNA缺乏有效的DNA 修复系统及组蛋白的保护，加之mtDNA位于线粒 体的内膜，很容易受各种因素影响而发生突变， 因此其突变频率约为nDNA的10～20倍，而且体 细胞mtDNA新生突变会随着年龄的上升而逐渐积 累。
一.什么是线粒体病
➢ 线粒体病（mitochondrial disease） 又称：线粒体细胞病 病因：线粒体（mitochondrial, mt）功能异常 （包括线粒体基因组、核基因组的遗传缺陷 以及二者之间的通讯缺陷）
➢ 发生率约为11.5/10万（约每8500人中有1 人）。
二.线粒体、线粒体DNA的结构ห้องสมุดไป่ตู้特点
➢ 而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用
Southern杂交检测到外周血中mtDNA的缺失。
2.基于PCR的几种方法用于点突变的分析
➢ PCR-限制性内切酶分析法：此方法利用突变位 点产生新的限制性内切酶切位点，将包含此突 变位点的一段mtDNA基因进行扩增，然后酶 切所得到的PCR产物，由突变mtDNA模板所 得PCR产物将被酶切成两个片段。用此方法可 检测3243 A→G和8433 A→G的点突变。
➢ 线粒体是细胞的能量工厂， 约90％的细胞ATP来源于 线粒体的氧化磷酸化。
➢ 不同组织细胞所 含的线粒体的数量不同，在能量需 求高的组织，如脑、骨骼肌、心脏 和肾脏等的细胞内有成千上万个线 粒体；而在能量需求较低的细胞内 仅有10～100个线粒体。
组成氧化磷酸化(OXPHOS)的蛋白质有： 电子传递链（electron transport chain, ETC）； ATP合成酶； 腺嘌呤核苷酸转换酶 （adenine nucleotide
➢ 在大量的正常人群中未能发现 ➢ 在有类似表现型却又不属于同一家系的患者中发
现相同的突变 ➢ 异质性的程度和临床生化缺陷严重程度正相关 ➢ 使用无线粒体的ρ0细胞系的细胞融合实验证实，
该突变可引起呼吸链缺损。
线粒体与细胞凋亡有关
➢ 细胞凋亡在线粒体病的发生中起重要作用。 ➢ 当细胞受损伤或在应急情况下，可诱导
线粒体的突变分为四类
➢ mtDNA编码蛋白基因的点突变 ➢ mtDNA编码tRNA基因的点突变 ➢ mtDNA的大片段重组包括片段缺失和重复 ➢ mtDNA数量的减少。
确定mtDNA突变是否致病的标准
➢ 种系发育中高度保守的序列或突变的碱基有明显 的功能重要性
➢ 异质性的存在，即野生型和突变型mtDNA共存于 一个细胞内
➢ 错配PCR：当一个突变位点所产生的酶切位点 不能用普通限制性内切酶所检测时，可用误配 PCR来检测。即将引物设计得使突变序列与引 物一起产生一个新的酶切位点，以便于检测。 另外将误配PCR与多重PCR结合，可同时检测 3243，8344，11778几个位点的突变。
➢ 分子诊断
线粒体病的分子诊断
1. Southern杂交
➢ mtDNA大片段重组的基本诊断方法。通常情况下杂 交片上只能得到一条大小为16.6Kb的条带，当有缺 失存在时，除了16.6Kb的条带外，还有一条分子量 较小的条带；而当有重复存在时，则还有分子量较 大的条带；
➢ 在有缺失的病人中，不同组织间野生型和突变型的 mtDNA的比例相差悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的 突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southern杂交 检测到缺失；
procaspases聚集活化，其中一条信号传递通路 是由线粒体释放细胞色素c开始的。 ➢ 释放到胞质的细胞色素c可与链接蛋白Apaf-1结 合，从而启动和放大Caspase激活过程，进而启 动细胞凋亡。
线粒体与细胞凋亡关系示意图
四.原发性线粒体病的临床分类
➢ 目前已经报道了50多种线粒体基因的点突变与疾 病有关，这些疾病包括肌病、心肌病、痴呆、肌 阵挛、耳聋、失眠、贫血、糖尿病和脑中风等。
➢ 主要影响骨骼肌的线粒体肌病:儿童和成 人均可发病，表现为肌无力和体力活动 时耐受力下降。
➢ 主要影响骨骼肌和中枢神经系统的线粒 体脑肌病:如母系遗传的神经病、共济失 调和视网膜色素变性 。
➢ 主要影响其它系统的线粒体疾病：如母 系遗传的糖尿病 。
➢ 衰老和老年退行性疾病：如帕金森病和 阿尔茨海默病
欧启水
福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学医学检验系
福建医科大学基因诊断研究室
➢ 1962年Luft等首先报道了一例女性患者，其主 要表现为肌无力、极度不能耐受疲劳、多汗， 甲状腺功能正常。
➢ 经生化证实为线粒体氧化磷酸化脱偶联引起， 并被确定为线粒体肌病。从此，线粒体异常引 起的一类疾病被确定为一组独立的疾病实体－ －线粒体病。
22个tRNA和13个氧化磷酸化过 程所需要的蛋白多肽。 ➢ 线粒体基因组各基因之间 无内含子，呈紧密排列。
线粒体DNA的特点
➢ 非孟德尔的母系遗传 mtDNA为母系遗传，发生在生殖细胞系中的突变 能通过女儿传递给子代，引起母系家族性疾病；
➢ 异质性与阈值效应 线粒体几乎存在于人体的所有细胞中，有害的突变 基因常常仅影响部分mtDNA，这就使细胞、组织 中同时存在野生型DNA和突变型DNA。当 mtDNA突变数目达到某一数量时，可引起某组织 或器官的功能异常而出现临床症状，这就是阈值效 应。
实验室检查
➢ 乳酸和丙酮酸盐：空腹血乳酸盐浓度 ≥3mmol/L和空腹脑脊液乳酸盐浓度＞ 1.5mmol/L支持线粒体病的诊断，但需排除其 他导致乳酸盐增高的原因。
➢ 血浆磷酸肌酸激酶（CK）：明显增高可能见于 线粒体DNA耗竭。
➢ 此外，实验室检查应注意结合影像学、神经生 理学、心电图和病理活检等检查。
translocator，ANT）
线粒体电子传递链示意图
线粒体DNA
➢ 半自主复制的细胞器，有独立的遗传装置。 ➢ 2～10个拷贝线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）/线
粒体。 ➢ mtDNA约占细胞总DNA的1％，环状，轻重两条链互
补。 ➢ 含16569个碱基，编码2个rRNA，
➢ 半自主复制与协同作用
mtDNA虽有自我复制、转录和编码功能，但该过 程还需要数十种nDNA编码的酶参加，因此 mtDNA基因的表达同时也受nDNA的制约，两者 具有协同作用
➢ 高突变频率
线粒体编码基因排列紧凑、无间隔区且部分区域存 在重叠。因此，任何突变都会累及到基因组中的 重要功能区域。同时，mtDNA缺乏有效的DNA 修复系统及组蛋白的保护，加之mtDNA位于线粒 体的内膜，很容易受各种因素影响而发生突变， 因此其突变频率约为nDNA的10～20倍，而且体 细胞mtDNA新生突变会随着年龄的上升而逐渐积 累。
一.什么是线粒体病
➢ 线粒体病（mitochondrial disease） 又称：线粒体细胞病 病因：线粒体（mitochondrial, mt）功能异常 （包括线粒体基因组、核基因组的遗传缺陷 以及二者之间的通讯缺陷）
➢ 发生率约为11.5/10万（约每8500人中有1 人）。
二.线粒体、线粒体DNA的结构ห้องสมุดไป่ตู้特点
➢ 而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用
Southern杂交检测到外周血中mtDNA的缺失。
2.基于PCR的几种方法用于点突变的分析
➢ PCR-限制性内切酶分析法：此方法利用突变位 点产生新的限制性内切酶切位点，将包含此突 变位点的一段mtDNA基因进行扩增，然后酶 切所得到的PCR产物，由突变mtDNA模板所 得PCR产物将被酶切成两个片段。用此方法可 检测3243 A→G和8433 A→G的点突变。
➢ 线粒体是细胞的能量工厂， 约90％的细胞ATP来源于 线粒体的氧化磷酸化。
➢ 不同组织细胞所 含的线粒体的数量不同，在能量需 求高的组织，如脑、骨骼肌、心脏 和肾脏等的细胞内有成千上万个线 粒体；而在能量需求较低的细胞内 仅有10～100个线粒体。
组成氧化磷酸化(OXPHOS)的蛋白质有： 电子传递链（electron transport chain, ETC）； ATP合成酶； 腺嘌呤核苷酸转换酶 （adenine nucleotide
➢ 在大量的正常人群中未能发现 ➢ 在有类似表现型却又不属于同一家系的患者中发
现相同的突变 ➢ 异质性的程度和临床生化缺陷严重程度正相关 ➢ 使用无线粒体的ρ0细胞系的细胞融合实验证实，
该突变可引起呼吸链缺损。
线粒体与细胞凋亡有关
➢ 细胞凋亡在线粒体病的发生中起重要作用。 ➢ 当细胞受损伤或在应急情况下，可诱导
线粒体的突变分为四类
➢ mtDNA编码蛋白基因的点突变 ➢ mtDNA编码tRNA基因的点突变 ➢ mtDNA的大片段重组包括片段缺失和重复 ➢ mtDNA数量的减少。
确定mtDNA突变是否致病的标准
➢ 种系发育中高度保守的序列或突变的碱基有明显 的功能重要性
➢ 异质性的存在，即野生型和突变型mtDNA共存于 一个细胞内
➢ 错配PCR：当一个突变位点所产生的酶切位点 不能用普通限制性内切酶所检测时，可用误配 PCR来检测。即将引物设计得使突变序列与引 物一起产生一个新的酶切位点，以便于检测。 另外将误配PCR与多重PCR结合，可同时检测 3243，8344，11778几个位点的突变。
➢ 分子诊断
线粒体病的分子诊断
1. Southern杂交
➢ mtDNA大片段重组的基本诊断方法。通常情况下杂 交片上只能得到一条大小为16.6Kb的条带，当有缺 失存在时，除了16.6Kb的条带外，还有一条分子量 较小的条带；而当有重复存在时，则还有分子量较 大的条带；
➢ 在有缺失的病人中，不同组织间野生型和突变型的 mtDNA的比例相差悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的 突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southern杂交 检测到缺失；
procaspases聚集活化，其中一条信号传递通路 是由线粒体释放细胞色素c开始的。 ➢ 释放到胞质的细胞色素c可与链接蛋白Apaf-1结 合，从而启动和放大Caspase激活过程，进而启 动细胞凋亡。
线粒体与细胞凋亡关系示意图
四.原发性线粒体病的临床分类
➢ 目前已经报道了50多种线粒体基因的点突变与疾 病有关，这些疾病包括肌病、心肌病、痴呆、肌 阵挛、耳聋、失眠、贫血、糖尿病和脑中风等。
➢ 主要影响骨骼肌的线粒体肌病:儿童和成 人均可发病，表现为肌无力和体力活动 时耐受力下降。
➢ 主要影响骨骼肌和中枢神经系统的线粒 体脑肌病:如母系遗传的神经病、共济失 调和视网膜色素变性 。
➢ 主要影响其它系统的线粒体疾病：如母 系遗传的糖尿病 。
➢ 衰老和老年退行性疾病：如帕金森病和 阿尔茨海默病