基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究 以 稻
瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建 HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体;2)分别用带
有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段;3) 克 隆 上、下 游 片 段 与 HPH-GFP 组 成 嵌 合 体 片 段;4) 嵌 合 体 片 段
Abstract:Geneknockoutisoneoftheimportantmethodstostudygenefunction.Usually,geneflankingfragmentsareusedtosubstituteitsgenomichomogeneoussequencesbyusingantibioticasselected marker,but therearestillmanyproblemstobesolved,likescreeninginefficiency,highfalsepositive,andcomplicatedoperation.Inthisstudy,weoptimizedtheknockouttechniquesusingafilamentousfungiMagnaportheoryzae asanexample.Thegeneknockoutstrategyincludes:1)HPH-GFPfusionexpressionvectorconstruction.2) Thespecificgeneflankingsequencesamplification;3)Thechimerafragmentscomposition;4)Fungiprotoplasttransformation.5)Transformantsidentification.Theresultsdemonstratedthatthemethodimprovesthe mutantidentificationefficientlybyusinghygromycinandGFPasscreenmarkers,whichcouldbesalutaryfor genefunctioninvestigationoffilamentousfungi. Keywords: filamentousfungi;geneknockout;Magnaportheoryzae;PCRamplification
收 稿 日 期 :2018-11-25 基金项目:国家科技支撑计划项目(2014BAD07B02);贵州省科技支撑(黔科合支撑[2019]2408号);贵州省科技厅 工 程 中 心 建 设 计 划 项 目(黔 科 合
农 G 字[2012]4004号);贵州大学引进人才科研基金(贵大人基合字[2017]54号)。 作者简介:谢 鑫(1984—),男,山西运城人;博士研究生,讲师,主要从事植物病理学教学及研究工作;E-mail:xiexin2097757@163.com。 通 讯 作 者 :任 明 见 (1972— ),男 ,贵 州 石 阡 人 ;教 授 ,硕 士 生 导 师 ,主 要 从 事 作 物 遗 传 育 种 及 分 子 生 物 学 研 究 ;E-mail:rmj72@163.com。
研究报告
谢 鑫 等:基于 PCR 的两步法丝状真菌基因敲除方法
Βιβλιοθήκη Baidu
基于 PCR 的两步法丝状真菌基因敲除方法
谢 鑫1,2, 蒋君梅1, 王 勇1, 任明见1,2 (1.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.国家小麦改良中心贵州分中心, 贵州 贵阳 550025)
摘 要:基 因 敲 除 是 研 究 真 菌 基 因 功 能 的 重 要 方 法 之 一,目 前,丝 状 真 菌 敲 除 多 采 用 基 因 两 侧 的 同 源 臂 对 基 因 组 的 靶 标
转化真菌原生质体;5) 对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素 HPH 作为筛选标记 外,
还可用 GFP 作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。
关键词: 丝状真菌;基因敲除;稻瘟菌;PCR 扩增
DOI编码: 10.16590/j.cnki.1001-4705.2019.04.015
中图分类号: S961.16
文献标志码: A
文章编号: 1001-4705(2019)04-0015-05
GeneKnockoutMethodofFilamentousFungiBasedon Two-stepPCR Amplification
XIEXin1,2,JIANGJunmei1,WANG Yong1,REN Mingjian1,2 (1.CollegeofAgricultural,Guizhou University,Guiyang550025,China; 2.GuizhouSub-CenterofNationalWheatImprovementCenter,Guiyang550025,China)
转化和基因 枪 转 化 等 。 [2-3] 基 因 敲 除 是 研 究 基 因 功 能 的手段之一,利用同 源 重 组 原 理 对 感 兴 趣 的 基 因 进 行 敲除,通过观察敲除 突 变 体 的 表 型 变 化 从 而 明 确 该 基 因 的 功 能 ,最 终 实 现 改 良 或 防 治 真 菌 的 目 的 。 目 前 ,常 用的基因敲除的方法有:1) 同源重组 基 因 敲 除,即 利 用基因两侧的同源臂在位点 特 异 性 DNA 重 组 酶 的 作 用下进行 基 因 敲 除,该 法 是 最 普 遍 的 基 因 敲 除 方 法;
真菌在自然界广 泛 分 布,与 人 类 生 活 的 各 个 方 面 都有着密不可 分 的 联 系 。 [1] 因 此 对 真 菌 进 行 研 究,尤 其对真菌的基因功能进行研究具有重要意义。通过对 真菌 DNA 进 行 遗 传 改 造 是 基 因 功 能 研 究 的 重 要 技 术,目前,对 丝 状 真 菌 进 行 遗 传 改 造 的 方 法 主 要 有 PEG 介导的原生质体转化、农杆菌介导的转化(A.tumeafeiensmediatedtransformation,ATMT)、电 击