丝状真菌基因组DNA的提取

1. 打开ClustalX软件（对序列进行比对），点击“文件”→“载入序列”；点击“比对” →“输出格式选项” →“phylip格式”前打勾；点击“比对” →“完全比对”；比对完成后，关闭程序，并将生成的带.phy后缀的文件拷贝至phylip软件包的“exe”文件夹下。

2. 打开seqboot软件，按照路径输入所拷贝的“.phy”文件，回车

3. 输入“r”，回车→输入1000，回车→输入“y”，回车→输入“5”，回车→出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序，完成seqboot（上图中的J选项代表评估方法，默认为bootstrap 法进行评估，可更改选项；R选项默认多少次，输入1000表示共进行1000次的republicate）。自动生成文件“outfile”，可用记事本打开。

4. 将刚刚生成的outfile文件更名为infile1，打开dnadist软件（采用邻位相连算法构建进化树，如采用其他算法，则用其他软件），按照路径输入文件名infile1，回车

5. 输入t，回车→输入20，回车→输入m，回车→输入d，回车→输入1000，回车→输入y，回车→等待……等待……等待……时间长度视序列多寡长短及重复数多寡而不等，直到出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序（D选项为距离模式，默认为F84；T选项为点突变的“转换/颠换比率”，通常在15～30之间；M选项采用和原来一样的重复数；输入d，采用data sets）。自动生成文件outfile。

6. 将outfile重命名为infile2，打开neighnor软件（采用邻位算法），按照路径输入infile2，回车

7. 输入选项m，回车→输入1000，回车→输入奇数5，回车→输入y，回车→等待……一定时间后出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序。生成两个文件outfile和outtree。Outfile是分析结果的输出报告，可用记事本打开，outtree可用treeview打开。

8. 将outfile更名为outfile1，outtree文件更名为intree1，打开consense软件，按照路径输入intree1，回车

9. 输入y，回车→等待……一定时间后出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序。生成两个新文件outfile和outtree。Outtree就是最终结果，可用treeview软件打开观看

丝状真菌基因组DNA的提取（CTAB法）

—取幼嫩的菌丝体，用液氮研成粉末，每0.8 g 装入10 mL 的离心管中；

—预热1.5×CTAB 到95 ℃，加2 mL 到装有菌丝粉末的离心管中，混匀；

—立即置于65 ℃水浴30 min，每分钟，上下颠倒1 次；

— 12000 g 离心5 分钟；

—吸取上清液，加等体积的氯仿，上下颠倒数次；12000 g 离心5 分钟；

—吸取上清液，加等体积的酚，上下颠倒数次；12000 g 离心5 分钟；

—吸取上清液，加等体积的氯仿，上下颠倒数次；12000 g 离心5 分钟；

—取上清，加入2 倍体积的无水乙醇和1/10 体积的10 M NH4Ac，混匀，室温放置10 min；

— 12000 g 离心10 分钟，去上清，用75% 乙醇洗沉淀，自然干燥；

—加100uL 的TE 或无菌水。

楼主，我也是做真菌转化的，有好的东西一起分享哈O(∩_∩)O~

中文有很多呀，微生物学报，菌物学报，微生物通报等！

英文的有：Mycotaxon（0.5左右）、studies in mycology（9.03左右）

详见如下：

/sci2010/smallclass/真菌学.html

ITS区域，内转录区间，是一段比较保守的区域，长度一般为700~800bp。一般PCR得到的ITS区域，测得序列在NCBI上BLAST后一般可以确定到属一级，但是一般应辅助以形态学鉴定才较为可靠。

用不用载体取决于你的实验室得到纯化后的真菌遗传指针信息然后送交测序公司即可(但是像上海生工这样的公司会要求你的DNA 的浓度为OD260/OD280到1.8至2.0 而且要你提供引物如果是经典的比如18S等的则不要否则经常会测不出信号如果实验室钱多那就送到TaKaRa 日本人的服务很全面而且质量可靠但是价钱奇贵) 如果你们实验室做载体连接比较多那就连个载体再送出去测序同样也要提供引物但这样的话可能会便宜一点但是这样就将测序的一部分风险转嫁到你自己的因素上了所以这完全取决于你的选择了祝你好运

不用连接，让测序公司电泳回收，直接把PCR产物送测，省时省力省钱，四天后能得到结果。

这样的帖子这几天有三张，加上以前的就更多了，楼主发帖之前先站内搜索一下就明白了，省力得多。不过楼主是昨天才加入的新人，以后会学会这招的。

因为PCR可能有非特异性扩增，造成除了目的条带之外还有干扰条带产生，他们都是用同一对引物扩增得来的，所以在测定序列的时候会在同一个碱基的位置上出现两个碱基反应同等强度，不知道正确的序列中应该是其中的哪一个，所以为了保证产物纯度，最保险的方法就是将PCR产物跑电泳，回收预计大小的条带。我以前是在有杂带时就会回收才送测，现在是写明目的条带在哪里，直接将PCR产物送测，让他们回收。花费是稍微多一点，但我的样品有二十几个，一个人回收要很久，公司人多，这样我得到结果就快得多。

问一下，我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增（引物27f，1492r，产生片段约1500bp）纯化都没有问题，连接载体pMDT19，连接后转化、涂布平板有单克隆出来，但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来，是什么原因呢？

构建另外一个目的基因克隆文库，同样的操作步骤，只是另外一对引物扩增出的是500bp 产物，克隆后菌落pcr能够成功。

我们实验室自行筛选了一株纤维素产生菌，经过高静水压诱变后得到了一株纤维素产量极高的突变株（纤维素产量是出发株的3倍多，也是目前资料报道中最高产的）。我把突变株的形态学、生理生化指标和系统发育都做了，根据结果对菌株做了分类鉴定。应老师要求，我将材料整理出来写成文章，没想到投了许多期刊，都以“研究内容不在本刊收录范围，建议