制备抗鸡单克隆抗体应用参考

制备抗鸡IgM单克隆抗体及其在免疫研究中应用摘要：从无特定病原体（SPF）的鸡血清中纯化免疫球蛋白M（IgM）并用于制备抗IgM单克隆抗体，以检测机体对传染源感染产生的初始免疫反应。采用Sephadex G-200凝胶过滤技术纯化鸡IgM。应用琼脂扩散试验（AGPT）技术和免疫电泳（IE）技术并用兔抗鸡血清来确定鸡IgM的纯度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）实验结果显示，非还原条件下观察到单一的条带，还原条件下检测到一条分子量为74kDa的条带。用经过（IgM）免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和SP2/0进行细胞融合，筛选阳性克隆并鉴定其亚型，并用ELISA法检测该抗体与IgY的交叉反应。选择其中3株亚型为IgG1的单抗进行ELISA实验，结果表明他们与标准的IgY没有交叉反应。本研究中所制备的高浓度IgM单克隆抗体用于检测人工感染EDS-76病毒的鸟的免疫应答，具体来说是应用ELISA法检测免疫过程中依次收集的鸡血清。用纯化的病毒包被ELISA板，依次加入待测的鸡血清，抗鸡IgM单克隆抗体、过氧化物酶标记的抗小鼠的二抗及底物。结果显示在个别接种5-12天的鸡中，免疫球蛋白M的含量在第9天出现峰值，而IgG含量在接种后12-15内出现峰值。在34个野外血清样本中检测出了抗传染性法氏囊病（IBD）病毒的IgM抗体。同时，在检测IBD特异性IgM抗体时，ELISA法的灵敏度比AGPT 略有增加。

关键词：鸡IgM抗体，酶联免疫法，免疫球蛋白，单克隆抗体

简介

导致鸡死亡率和产出下降的许多病毒性疾病的蔓延是制约家禽业发展的主要因素。病毒性疾病既可通过分离致病病毒来检测，也可通过测抗体效价是否已经达到致病病毒水平来检测。在各种检测工具中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用和最广泛的工具，并已经发展成评价和检测血清中抗体转化的工具。但是目前在所有的ELISA检测试剂盒中所使用的抗鸡IgG的结合物无论是在轻链抗原或重链抗原表位都有可能与其他类别的免疫球蛋白产生交叉反应，如通过具有交叉反应链的IgM和IgA来产生交叉反应。免疫球蛋白IgG，IgM和IgA普遍存在于鸡与其他类哺乳动物体内。从鸡血清中分离得到的免疫球蛋白IgM具有很高的分子量（900 kDa），可以被还原作用降解为80 kDa 的重链和22 kDa的轻链。初次免疫后可以最初检测到鸡免疫球蛋白IgM，这种抗体是通过大多数鸡B细胞表面分泌的。在一个免疫反应的过程中，接种一周内的第五天左右产生的IgM效价最高。在级交换期间同时也造成了IgG类抗体的积聚。抗原特异性IgM 的含量表明一种疾病的发病率，而IgG抗体的含量则表明疾病的流行。对抗原特异性IgM 的检测要求提供单克隆抗体IgM的特定/血清。免疫球蛋白类特定单克隆抗体杂交瘤细胞可以通过开发技术来获得。

鸡IgM的单克隆抗体可直接从近期感染病毒，细菌和寄生虫的家禽血清中获得。凝胶过滤色谱法分离血清的方法出现后，检测鸡传染性支气管炎病毒感染产生的特异性IgM抗体的ELISA法也相继出现，这使它不适合大量样品的常规检测。对于这个实验，通过增加血清的量，用纯化的IBV包被ELISA板，抗鸡的单克隆抗体IgM作一抗，抗小鼠过氧化物酶和底物结合进行检测可以得到。因此，此反应只能对传染性支气管炎病毒特异性IgM的进行评估。凝胶过滤层析保证分离血清IgM抗体，以消除跨类IBV的对抗竞争。Westernbrink和Kimman证明这种ELISA法捕获IgM试剂盒的研制是敏感的，足以检测在实验中受感染动物IgM的水平。用一种抗体捕获ELISA法被形容为检测鸡传染性支气管炎病毒特异性IgM的响应，所有这些IgM单克隆抗体都可用作具体检测或用作ELISA法中的捕捉抗体。

本研究的三个目的：

一）用色谱技术分离与纯化鸡的免疫球蛋白；

二）鸡IgM单克隆抗体的制备及大量生产；

三）单克隆抗体IgM的生产应用于家禽生产中感染的诊断。

材料与方法

IgM的色谱分离法

西方购买的SPF鸡蛋孵化场，Nandanam家禽研究站孵化出来的Pune。动物生物技术部2周的无菌，用美联储和流动水喂养的小鸡。通过离心获得血清池，硫酸钠18％（重量/体积终浓度）时获得r-球蛋白沉淀。免疫球蛋白不溶性悬浮颗粒是通过磷酸盐缓冲生理盐水透析（PBS）得到的。硫酸钠沉淀池的SPF鸡血清分别用凝胶过滤层析分级，PBS 层析装置洗脱（生物拉德100 ×2.6厘米玻璃柱挤满葡聚糖-200）。第一个高峰处的研究通过汇集鸡血清IgM组分，用分光光度计测定了280 nm光密度值（OD）。如Hay和Hudson 所述，蛋白浓度（mg/ mL）为OD值乘以因子0.74。通过琼脂扩散试验（AGPT）或免疫电泳（IE）进行免疫球蛋白M的洗脱组分纯度和特异性的检测，通过常规电泳程序检测兔卵黄得到的全血。

抗鸡IgM的单克隆抗体的制备与鉴定

实验动物：3只6-8周龄BALB/C雌鼠，购于海得拉巴（印度第六大城市）国际营养研究所。

实验方法：用纯化并修饰过的鸡IgM免疫小鼠，用100uL弗氏完全佐剂（美国Sigma 公司）乳化100ug IgM抗原，注入小鼠腹腔。每隔15天对其进行加强注射，注射抗原为弗氏不完全佐剂（80uL）乳化的鸡IgM(80ug)。最后，融合前3天每天静脉加强注射一次，注射液为溶于PBS的25ug抗原，根据Galfre and Milstien的标准程序进行融合。当杂交瘤细胞占据培养孔底50%时，收集培养上清应用ELISA间接法检测IgM抗体，检测步骤如下：用纯化后的鸡IgM为包被抗原溶于包被缓冲液（0.125ug/mL），以100uL/孔的量加入ELISA酶联板，4℃过夜。在每步中，每孔加液量要与包被时的量保持一致。翌日，用PBST洗涤酶联板，并用2%BSA封闭非特异性结合位点，在37℃反应1h，再次洗涤后依次加入小鼠抗血清的稀释液（对照）以及细胞培养上清在37℃孵育2小时，然后加入以辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG（用PBS以1:2000稀释），在37℃孵育1小时，加入ABTS，405nm下读取显色产物的OD值。阳性对照组（小鼠超免疫血清），阴性对照组（骨髓瘤SP2/0细胞株培养上清），结合物组，及底物组。光密度值大于阴性对照组两倍以上的实验组可以认为是阳性（P/N≥2.0）。杂交瘤细胞分泌的抗IgM抗体通过有限稀释法进行