马铃薯原生质体培养和体细胞杂交

• 一、马铃薯原生质体的分离与纯化
• 马铃薯原生质体分离、培养和植株再生都必须在无菌条件下进 行。
• （一）外植体的选择
• 要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组 织作材料。细胞悬浮培养物是最常采用的作为分离原生质体的 材料。而叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料。
• 马铃薯试管苗叶片、实生种子子叶和下胚轴都是获得马铃薯原 生质体的常用供体材料。
项目十 马铃薯原生质体培养
和体细胞杂交
• 知识目标 • 1.了解马铃薯原生质分离、培养的基本理论和方法； • 2.掌握马铃薯体细胞杂交的原理和方法。
• 技能目标
• 掌握马铃薯原生质分离、原生质体培养、体细胞杂 交的方法技术。
• 原生质体是去除细胞壁的裸露植物细胞。 • Klereker在1892年首先用利刃对细胞进行机械切割
• 最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一 薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体 的液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以慢慢 地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，培养 物所产生的一些有害物质，也会被固体部分吸收，对 培养物的生长更有利。
• （二）马铃薯原生质体的培养过程
• 2. 液体浅层培养
• 即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。 是目前较常用的一种方法。其优点是方法操作简便， 对原生质体伤害较小，便于添加培养基和转移培养 物。缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易 造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步 的生长发育．并且难以定点观察。
• 3. 固液结合培养法
• 目前常用的融合方法有：
• (一) 物理方法
• 主要采用电融合的方法。这是70年代末80年代初开始发 展起来的一项融合技术。
• 电融合仪中有一个融合室，把有一定密度的原生质体悬 浮液置于其中，小室两端装有电极。在不均匀交变电场 的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链， 再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从 而导致融合。
• 二、马铃薯原生质体的培养
• 当原生质体再生出细胞壁后就恢复第一次分裂，具有再生 能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。当细胞团 进一步发育就成为肉眼可见的愈伤组织，及时转移到分化 培养基中，进行诱导分化培养，最后形成完整的再生植株。
• （一）原生质体的培养方法
• 原生质体的培养方法大体和细胞培养相同，有固体培养、 液体培养及固液结合培养等几种方法。在原生质体培养及 其植株再生的不同阶段中使用不同的基本培养基和激素。
• （二）马铃薯原生质体的分离
• 常用的分离方法有机械法（利刃机械切割）和酶解法，但 目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。
• 具体分离步骤如下：
• 1. 材料预处理
• 在30001x连续光照、25℃±2℃下培养的无菌实生苗子叶 和下胚轴，或在3 000～40001x的16h光照、18～20℃下培 养3周的试管苗叶片(上部3～4片)，分离的原生质体产量和 质量都好。
而获得原生质体，但数量和效率都较低。
• 1960年，英国植物生理学家Cocking首先用真菌培 养物中的纤维素酶来降解番茄幼苗的根细胞壁，分 离原生质体获得成功。
任务一 马铃薯原生质体培养
• 马铃薯原生质体的培养始于1973年，1977年获得成 功。经过40多年的发展，已建立了分离和培养原生 质体的较完善的方法。原生质体是细胞融合和杂交 的基础、基因转移的理想受体、体细胞变异的重要 来源、许多基础研究的理想实验体程。
• 一、细胞融合的方法
• 根据原生质体是否同源，原生质体融合方式可分自发融合 和诱导融合两种。在酶解细胞壁过程中，有些原生质体能 彼此融合形成同核体，这叫做“自发合”(Spontaneous fusion)，这是由于不同细胞的胞问连丝扩展和粘连造成的。 在体细胞杂交中，彼此融合的原生质体应来源不同。因此， 自发融合是无意义的。我们需要的是不同种的细胞融合， 要使他们融合，一定要用物理或化学的方法来诱导，这种 融合就称为诱导融合。
• 2. 原生质体分离
• 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素 酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处 理一次即可得到分离的原生质体。
• （三）原生质体纯化与搜集
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团、组织碎片 等，必须把杂质和酶液除去，才可以继续培养。收集和纯 化的方法有：离心沉淀法、漂浮法、接口法三种。其中最 常用的是离心沉淀法，即采用过滤和离心相结合的方法。
• 1. 固体培养法
• 该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼 脂的培养基或琼脂糖等量混合，使琼脂的最终浓度 为 0.6％左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。 这种方法的优点是原生质体被机械地彼此分开并固定 了位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响并便于定 点观察，追踪单个细胞的发育过程。缺点是琼脂熔点 较高，琼脂对原生质体是有毒害的。
• 三、影响原生质体培养及植株再生的因素
• 影响原生质体培养及植株再生的因素有来自所选外植 体和培养条件两方面的因素，在培养过程中主要注意 选择最适的培养条件以保证获得原生质体成功培养。
任务二 马铃薯体细胞杂交
• 植物体细胞杂交（Somatic hybridization）是指将植物不同 种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然 后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具 有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只 有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细 胞融合也称为原生质体融合（Protoplast fusion ）。
• 首先，用原生质体培养液调整原生质体密度为2×100～ 1×105个/ml，吸3 ml液体置直径6cm的培养皿中，浅层静 置培养在300lux或暗培养，（25±2)℃，48h可观察到第一 次细胞分裂，1个月左右，形成1mm左右肉眼可见的愈伤 组织。
• 将愈伤组织转移至含固体培养基的直径6cm培养皿中，在 1000 lux连续光照、（25±2）℃下培养1个月。然后将愈 伤组织转移至分化培养基中，在2000lux连续光照下，诱导 芽分化。待芽长至lcm时，切下转入生根培养基，促使完 整小植株形成。