纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理

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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.3.1典型的纤维小体外切酶（或持续性 内切酶）的空间结构
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.3.2典型的纤维小体内切酶的空间结构
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Figure 4.4.3 Structural comparison of (α/α)6 glycosyl hydrolases
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程
4.6.1 纤维素酶分子-底物之间的结合过程
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
纤维素酶通过结合结构域吸附到底物上； 定位于底物表面上特定的化学键上； 形成酶-底物复合物； β-糖苷键的水解，同时酶分子沿着纤维素链前进； 纤维素酶从底物脱吸附，或重复第4步，当催化结 构域离开纤维素链时重复第2、3步； β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖。 反应过程存在产物的抑制，及底物结构变化对酶分 子催化过程的影响等因素。
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4.2 纤维素酶系统的组成
根据各酶的功能可分为三大类： (1)内切葡聚糖酶（endo-1,4-β -Dglucanase,EC.3.2.1.4, 来自真菌的简称 EG ，来自细菌的简称Cen）,这类酶作 用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解 β -1，4-糖 苷键,将长链纤维分子截断,产生大量非还原性末端的小 分子纤维素。 (2)外切葡聚糖酶(exo-1，4-β -D-glucanase，EC.3.2.1.91， 又称纤维二糖水解酶，来自真菌简称CBH，来自细菌简称 Cex。）这类酶作用于纤维素分子的非还原端,依次水解 β -1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子。
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.6 纤维小体基因在基因中的分布规律
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.7 微型人造小体的研究进展
纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器。 现在已提出了通过理性人工设计并通过工程手段提高 天然纤维小体降解活力的新思路 。 可行性依据： 1）对于细菌的粘连模块和对接模块，无论是单独生成 还是移植到异源性的蛋白质上，它们都能忠实地保持 自身的生物学性质。 2）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体的细菌种 类之间具有物种专一性。
图4.4 热纤梭菌脚手架蛋白上的CBM结 构示意图
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.4.2酶分子的CBM

酶上的CBM不是保持酶复合体接近底物表面所必需的 结构。然而其具有潜在的功能，似乎是单个酶专一性 结合底物，特别是其在分子水平上结合单个底物分子 链（如可溶性的β - 葡聚糖或木聚糖链）。 酶分子模块上的CBM既有A型也有B型。
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能

当多个不同蛋白质中都存在一个相同或相似的结构域 时，该结构域称之为模块。每一纤维素酶分子包含催 化模块和碳水化合物模块（CBM）。 基于结构和功能，将不同CBM分成三类：

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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能

决定了纤维小体的结构，并纤维小体各亚基的整合仅依 赖于此。 主要以疏水作用相联系，并辅以相对较少的分子间氢键。 热纤梭菌中Ⅰ型粘连模块与对接模块的相互作用是目前 已知最强的蛋白质间相互作用之一。


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4.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用

粘连模块与酶上对接模块在种内的结合是非专一性的， 而在种间的相互作用却是专一性的。生化水平上，包 含对接模块的酶与包含粘连模块的脚手架间的结合本 质上是非特异性的。 对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块 发生了构象变化。
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程
4.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程
4.6.2.1 酶分子-底物复合物

待酶分子与底物结合构象变化形成稳定复合物后，催 化断键是瞬间发生。一般通过分子动力学/量子力学 (MM/QM)，的方法进行研究。

对外切纤维素酶CBH I 的分子动力学模拟，CBH I 的 催化孔道与糖链之间有分子间氢键作用，糖分子所有 的羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶-底物 复合物的作用。
厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.4 碳水化合物结合模块CBM
（carbohydrate-binding module)

根据序列和结构的相似度，CBM可被分成不同的家族。 不同纤维小体家族中按功能分主要属于A型和B型。
4.4.4.1 脚手架上的CBM
脚手架蛋白上往往包含一个 CBM，它被认为负责将多酶复合体 锚定在相应底物上（虽然在瘤胃球 菌的纤维小体中没有发现）,其属 于A型。 热纤梭菌脚手架蛋白CBM的三 维结构已经被解析其拓扑结构为一 个由9个β 片层组成的果冻卷。

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图4.4 热纤梭菌Ⅰ型粘连模块红色和 Ⅰ型对接模块蓝色相互作用示意图
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.3 纤维小体上的催化模块
以热纤梭菌为例，它既有纤维小体酶系，也有游离的 非纤维小体酶。区别纤维小体酶与游离酶的关键特征 是，纤维小体酶带有对接模块 。 催化模式具有多种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖 内切酶活性、持续降解的纤维素内切酶活性、纤维素 外切酶。

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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.1 催化结构域及催化断键机理
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能

图4.9
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.1 催化结构域及催化断键机理

有待研究的问题：
1.结晶纤维素表面如何游离出单根葡聚糖分子链。
2.单根葡聚糖链如何快速准确地进入CBH的催化孔道中。 3.葡聚糖链如何在催化孔道中高效地持续性单方向运动。
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程
4.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程
4.6.2.2 共价糖基-酶中间体的形成

催化循环的第一步
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程
4.6.2.3 异头碳的恢复
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程
4.6.2.3 异头碳的恢复
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导言
自从 1906年在蜗牛消化液中首次发现纤维素酶后， 人类对其研究经历了百年历史： 1950--木酶的发现，C1-Cx假说。 1980 年至 1988 年--利用基因工程的方法对纤维 素酶的基因进行克隆和一级结构的测定。 90年代--厌氧细菌纤维小体超分子复合体结构功能 研究，多结构与体系的发现。 21世纪--基因及氨基酸序列，分子时代。
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能

CBM的功能 推测其功能是将催化结构域拉近到不溶 性的纤维表面，使纤维素水解过程易于进行。 但是其功能及催化中的分子机理仍未形成共识。
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.3 链接区的结构与功能
纤维素酶的模块结构通常由韧性的糖基化连接区连接 在一起。 其有效长度及柔韧性也是酶催化过程的关键。 富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸。
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4.2 纤维素酶系统的组成
(3)β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase,EC.3.2.1.21, 简称 BG）,这类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡 糖生成葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖的水解很 快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。
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4.3 糖苷水解酶家族

以底物专一性为基础建立的命名方法不能反映酶分子 的结构特性。 把作用于碳水化合物的相关酶类分成许多蛋白质家族， 形成专门的数据库共享。 碳水化合物活性酶 (CAZy)分类系统，只对结构域进 行定义。 CAZy中某一基因的结构域以模块表示。


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图4.2
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4.4厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在细 胞壁上产生隆起的细胞结构即为纤维小体。

不同生物体之间纤维小体结构相似，但其组成成分随 着种的不同而有所差异。 纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强。

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4.4.1 纤维小体的一般组装模式

结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架蛋白 等 催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等
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4.5好氧真菌纤维素酶的结构与功能

好氧真菌分泌的纤维素酶分子一般都由一个糖基化的 连接肽将一个较大的催化结构域和较小的纤维素结合 结构域连接起来构成。
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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.1 催化结构域及催化断键机理

纤维素酶催化断键功能相似，但属不同糖苷水解酶家 族。 T.reesei是纤维素酶体系研究最为深入的好氧真菌。 其中CBH I是该菌所产主要的外切酶。 催化中葡聚糖异头碳的构型并不发生变化。 水解主要产物是纤维二糖。
第四章
纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理
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4.1 导言

纤维素类生物质是自然界中最丰富的。与淀粉在结构上 的差别仅在于糖苷键连接方式不同。 多与半纤维素、木素相互结合在一起。 纤维素酶系统 非复合：真菌、放线菌 一般由菌丝分泌到胞外分别发挥作用。 复合： 厌氧菌（热纤梭菌） 在其细胞壁上产生隆起的细胞结构，为纤维小体。


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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.2.2对接模块

由大约具22个氨基酸的两条重复序列组成 钙离子促使对接模块折叠，并使其形成稳定的三级结 构。也是粘连模块-对接模块相互作用所必需的。 对接模块与其相应的粘连模块的分支情况相对应。


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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.2.3粘
厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.4.3纤维小体和游离酶上的CBM比较

CBM蛋白质的种类及其所属家族都是高度不同的。 但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同的。


有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不 存在。
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.4.4 影响小体与底物结合的因素



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好氧真菌纤维素酶的结构与功能
4.5.3 链接区的结构与功能
虽然许多结构域三级结构已得到解析，但目前还 没有一个包含完整纤维素酶的三维结构获得解析。
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4.6 纤维素酶持续性降解结晶纤维素 的动态催化过程
结晶纤维素的降解是纤维素降解的关键限速步骤。持 续性作用的外切纤维素酶是降解结晶纤维素的主要酶类。 可分为两个过程： 纤维素结晶超分子结构的破坏。（需外加能量） 糖苷键的断裂。（为酶催化反应，是动力学过程）

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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.7 微型人造小体的研究进展

与天然纤维小体相比，有三个主要的不同之处： 1）含有酶的数量有限。 2）是同源性的。 3）每个酶在微型手脚架蛋白上的位置是受到控制的。

未来前景包括构建新的杂交手脚架蛋白，使之能够将 三个或多个不同的酶结合到特定位点上。嵌合体的稳 定性也是影响它将来工业化应用的一个因素。

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③
②
④
①
纤 维 小 体 的 一 般 组 装 模 12 式
4.4.1
对接 模块
粘连 模块
4.4.1 纤维小体的一般组装模式
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.2 粘连模块与对接模块
4.4.2.1 粘连模块

不同厌氧微生物的粘连模块序列差异很大。 同一个脚手架蛋白上的粘连模块一般为同一类型，不 同粘连模块之间有不同的序列相似性。 目前型和型粘连模块晶体结构已测定。

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有限资料表明，纤维小体的组成和分布会受到碳源的 影响，另外纤维小体的某些结构蛋白和催化组分基因的 表达也受到生长速率的影响。
厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.5纤维小体的多样性
图4.5
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.5纤维小体的多样性
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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.5纤维小体的多样性
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纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程

弱离子强度能抑制纤维小体结合纤维素。 水分子能够从纤维素基质中释放至少部分的纤维小体 或CBM。 适当增加溶液中的盐含量可提高纤维小体对底物的亲 和能力。 吸附底物次优条件下，纤维小体复合体的酶活力最高。


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厌氧细菌纤维素酶的结构与功能
4.4.5纤维小体的多样性
根据纤维小体上脚手架蛋白的数量，可以被分为两类: 第一类：解纤维梭菌、食纤维梭菌、约氏梭菌、丙酮丁醇梭 菌、等嗜温梭菌产生的纤维小体。只发现了Ⅰ型的粘连 模块和对接模块。（6~9个） 第二类：热纤梭菌、解纤维醋弧菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维 素拟杆菌。复杂程度高。