分子标记及其在植物遗传育种中的应用优秀课件

AGTACT 3' TCATGA TCATGA 5'
anneal primers @ 60˚ C
Taq polymerase binds 3’ and extends
5'
GCTCGC
GCTCGC
3'
CGAGCG
AGTACT 3' TCATGA TCATGA 5'
DNA is doubled with each cycle
RFLP标记特点
共显性，可以区别纯合和杂合基因型 稳定、重复性强 某些植物中开发探针已遍及整个基因组 缺点：DNA需要量较大，技术复杂；
用于做图较费时，难以分析大量样品； 在基因组较大、严格自花授粉作物上多态 性很低，使遗传图饱和度低。
RAPD
原理： ➢ 用一个随机引物（8-10bp）、碱基随
Step1 Step2 Step3 Step4 Step5 Step6
95℃ 2分钟 95℃ 15秒 36℃ 30秒 72℃ 45秒 GOTO Step2 46循环
72℃ 5分钟
主要特点
• 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； • DNA需要量少，引物便宜，成本较低； • 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂
分子标记及其在植物 遗传育种中的应用
遗传标记
（genetic marker）
• 性状标记
具有多型性 易于鉴别 与目标基因紧密连锁
色泽， 形态…
• 细胞学标记
倒位，易位，G/N/C带…
• 生化标记
基础基因表达
结果 表现型
同功酶…
• 分子标记
RFLP、RAPD、SSR、 AFLP、SNP… …
DNA碱基 序列变异
交和放射性自显影等技术。 • 不同物种间引物通用； ❖ 缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
酶切—电泳—印迹
酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：EtBr染色20分钟 变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印迹 冲洗：以2×SSC 冼胶，风干
—放射自显影
将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室 中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一 张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置70℃超低温冰箱中曝光10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。
RFLP探针
来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探 针
cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频 率较低。
—杂交—洗脱
预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5× HSB、DenhardtⅢ）中， 封好后置65℃温 箱中振荡5－6小时。
杂交：预杂交液中加入标记好的marker和 探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置 65℃温箱中振荡过夜。
洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃ 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。
分子标记
本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，
与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂
合基因型，提供完整的信息。
RAPD—Random Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR)
SSR —Simple Sequence Repeat AFLP —Amplified Fragment Length
Polymorphism
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
分子标记的分类（Staub等1996）
以Southern为基础如RFLP
分
子
单引物PCR标记 有RAPD、
标
AP-PCR、DAF、ISSR等
记 以PCR 双引物选择性扩增PCR 主要指AFLP
为基础 需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记
如SSR、STS等
植物遗传研究中常用的分子标记
RFLP — Restriction Fragment Length Polymorphism
随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展， 可在染色体水平揭示更多遗传变异。
❖ 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限， 当染色体数目形态相似时难以分辨。
生化标记——贮藏蛋白和同工酶
贮藏蛋白 • 同工酶 ❖ 特点：经济、方便、成本较低 ❖ 结构基因表达产物，对非结构基因无能
为力；所检测位点只是基因组一部分； 数量有限，有时受发育时期和环境影响。
Repeat 25-40 times
RAPD的操作
PCR反应：
DNA（20ng/µl） 1µl
Primer 10×Buffer
15ng 2.0µl
Mg2+（25mM）
1.2µl
Taq酶（5U/µl）0.15µl
dNTP（25mM） 0.2µl
加水至20µl，再加入石腊油，进行PCR扩增
PCR扩增：
机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩 增基因组DNA，然后电泳分开扩增片 段。
Polymerase Chain Reaction-PCR
Target DNA sequence
5'
GCTCGC
3'
CGAGCG
denature @ 95˚ C
AGTACT 3' TCATGA 5'
5'
GCTCGC
3'பைடு நூலகம்
CGGCATCGGCCG
gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种 属特异性较强。
玉米RFLP探针： http://www.maizegdb.org/probes. Html
探针标记—随机引物法
25 ng变性DNA 5ul 寡聚核苷酸 2ul BSA 3ul [α-32P]dCTP 2ul Klenow酶 加水至50ul，37℃温箱中标记2小时
形态标记
遗传学上稳定、可见的外部特征 ---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 ❖ 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等
环节，表型差异有时难以反映基因型差异。
细胞学标记
染色体数目变异及结构变异，表现在染色体 核型（数目、大小、随体、着丝点位置等） 和带型（C带、N带、G带等）。