薄层色谱法分离鉴定叶绿素

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5 mL 80%丙酮溶液 80%丙酮溶液
薄
色
自 上 而 下
素 叶绿素
层 色 谱
色的
法 分 离
绿色的叶绿素a 绿色的叶绿素a 绿色的叶绿素b 绿色的叶绿素b
鉴 定 叶 绿 素
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乙醇、丙酮等有机溶剂提取。在波长662 nm、 nm测定 乙醇、丙酮等有机溶剂提取。在波长662 nm、644 nm测定
薄 层
吸光值，可根据公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量。 吸光值，可根据公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量。通过 薄层色谱(TLC)对叶绿体色素提取液进一步分离 薄层色谱 (TLC)对叶绿体色素提取液进一步分离， 可分离 (TLC) 对叶绿体色素提取液进一步分离， 叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素及去镁叶绿素， 叶绿素a 、 叶绿素b 、 β- 胡萝卜素及去镁叶绿素， 经多次 制备可得少量叶绿素纯品，并进行光谱表征。 制备可得少量叶绿素纯品，并进行光谱表征。
叶绿体色素的分离: 3. 叶绿体色素的分离: (1) 硅胶G薄层板活化及层析液的制备： 硅胶G薄层板活化及层析液的制备：
硅胶G 硅胶G薄层 板活化 硅胶G 硅胶G薄 层板 100～ ℃烘箱 100～120 ℃烘箱 干燥箱中 保存 烘30～60 min 30～ mL丙酮 丙酮︰ 10 mL丙酮︰石油醚 层析缸 (2︰3)层析液 (2︰3)层析液 振荡 析缸盖 轻轻 盖上层 静置 10～ 10～15 min
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122. 122.2 实验原理
植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类， 植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类， 主要包括叶绿素a 叶绿素b 主要包括叶绿素 a 、 叶绿素b 、 β- 胡萝卜素及叶黄素等四 种。 叶绿体色素是脂溶性色素， 叶绿体色素是脂溶性色素，植物叶绿体色素通常可用
122. 122.4 注意事项
研磨叶片时要将其尽量剪碎， (1) 研磨叶片时要将其尽量剪碎 ， 使叶片得到充分 研磨；研磨至叶片发白为止。 研磨；研磨至叶片发白为止。 层析液倒入层析缸后， 盖上盖子， (2) 层析液倒入层析缸后 ， 盖上盖子 ， 让其气相饱 min以上 否则分离效果不佳。 以上， 和10 min以上，否则分离效果不佳。
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叶绿体色素的提取： 2. 叶绿体色素的提取：
薄 层 色
30 大 叶黄杨叶片
谱 法 分 离 鉴
通 入 叶片 速
中 0
用不 滤
定 叶 绿 素
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(1)提取液的粗提纯： (1)提取液的粗提纯： 提取液的粗提纯
样 分 离开 点 点的 的 离 离
薄 层 色 谱 法 分 离 鉴 定 叶 绿 素
计算比移值Rf
Rf =
展开剂
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叶绿体色素的光谱表征： 4. 叶绿体色素的光谱表征：
分别用干净刮刀 将层析板上分开的 叶绿素a和叶绿素b 叶绿素a和叶绿素b的色带 提取 通过紫外可见光谱法 进行定性鉴定 刮入试管
层析液的 制备
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(2) 点样
薄 层 色
板 硅胶G 硅胶G 薄层板 线
1 5
m 线
线
上12 上12 线
m 线 用干燥干 线 的 在
谱 法 分 离 鉴 定 叶 绿
干
剂 6～
轻
素
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胡萝卜素在层析液中的溶解度大， 胡萝卜素在层析液中的溶解度大 ， 对薄层板的吸附能力
薄 层
小，所以移动最快。 所以移动最快。
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(3) 试比较叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素的极性， 试比较叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素的极性，
薄 层
为什么β 胡萝卜素在薄层板上移动最快？ 为什么β-胡萝卜素在薄层板上移动最快？
色 谱 法 分 离 鉴 定 叶 绿 素
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122. 122.6 参考答案
绿色植物叶片的主要成分是什么？ (1) 绿色植物叶片的主要成分是什么 ？ 提取液可能 含有哪些化合物？ 含有哪些化合物？ 色素主要成分有脂溶性和水溶性色素， 答 ： 色素主要成分有脂溶性和水溶性色素 ， 脂溶性
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色素主要为叶绿素与类胡萝卜素 ， 水溶性色素主要为花 色素主要为叶绿素与类胡萝卜 素
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122. 122.5 问题讨论
绿色植物叶片的主要成分是什么？ (1) 绿色植物叶片的主要成分是什么 ？ 提取液可能 含有哪些化合物？ 含有哪些化合物？ 薄层色谱分离色素原理是什么？ (2) 薄层色谱分离色素原理是什么？
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当它们通过薄层板时 ， 这种分配或吸附过程反复多次
薄 层
地进行，最后将它们一一分离开来。 地进行，最后将它们一一分离开来。
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mL石油醚 15 mL石油醚 分液漏斗 上步的提取液 静置30s 静置30s mL蒸馏水 15 mL蒸馏水 mL饱和食盐水 5 mL饱和食盐水
分层
分去 下部水层
mL饱和食盐水 5 mL饱和食盐水 mL蒸馏水 15 mL蒸馏水
分去 下部水层
得到 提取液
转入棕色瓶 中保存
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展开： (3) 展开：
液面不能 超 过点样线 盖好盖子 点好样的 硅胶玻片 层析缸 进行上行层析 要尽可能多地分 离叶片各种色素
待展开剂上升到终点线 附近时(约20～30 min) 附近时( 20～ 取出并在通风橱内晾干
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鉴定： (4) 鉴定：
观察各斑点的颜色
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(2)提取液的进一步提纯： (2)提取液的进一步提纯： 提取液的进一步提纯
提 的 提取液 用保 1000 m 10 m 转 取 液 上层 保存
薄 层 色 谱 法 分 离 鉴
0 5 的色 提取液 转入 5 mL 瓶中 用石油醚 色
m 在 m的 m的 m
定 叶 绿 素
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122.3 实验步骤
大叶黄杨叶片预处理： 1. 大叶黄杨叶片预处理：
清水洗净 采集新鲜成熟大叶 黄杨叶若干 迅速捞起 凉水中冷却 用滤纸吸干叶片表面水分 分批 投入沸水中 不断搅拌30 不断搅拌30 s
(3) 试比较叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素的极性， 试比较叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素的极性， 为什么β 胡萝卜素在薄层板上移动最快？ 为什么β-胡萝卜素在薄层板上移动最快？ 极性： 叶绿素b 叶绿素a 胡萝卜素； 答 ： 极性 ： 叶绿素 b ＞ 叶绿素 a ＞ β- 胡萝卜素 ； β-
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薄 层
色甙类，又称花青素。提取液可能含脂溶性色素。 色甙类，又称花青素。提取液可能含脂溶性色素。
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薄层色谱分离色素原理是什么？ (2) 薄层色谱分离色素原理是什么？ 答 ： 薄层色谱分离色素原理是利用不同色素在各种 有机溶剂中的分配系数或在吸附剂上的吸附能力的不同 ， 有机溶剂中的分配系数或在吸附 剂上的吸附能力的不同， 剂上的吸附能力的不同
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薄层色谱点样时，尽量使斑点小，直径不超过5 (3) 薄层色谱点样时，尽量使斑点小，直径不超过5
薄 层
mm，若斑点颜色较浅，可反复点直至其呈深绿色。 mm，若斑点颜色较浅，可反复点直至其呈深绿色。 大叶黄杨叶薄层色谱分离一般可得橙黄色β (4) 大叶黄杨叶薄层色谱分离一般可得橙黄色β-胡 萝卜素、灰色的去镁叶绿素、蓝绿色的叶绿素a 萝卜素、灰色的去镁叶绿素、蓝绿色的叶绿素a及黄绿色 的叶绿素b色带。 的叶绿素b色带。
实验122 实验122 薄层色谱法分离鉴定叶绿素
122.1 实验目的
掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。 (1) 掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。
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(2) 掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。 掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。
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