基因突变、基因重组和染色体变异列表比较(完整资料)

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基因突变、基因重组和染色体变异列表比较

比较TAＬEN技术与ＺFＮ技术

重组锌指核酸酶(zinc－fingeｒnucleaｓes,ZFN）技术与转录激活因子样效应蛋白核酸酶（trａnsｃrｉｐtion activaｔor-ｌikｅｅｆｆｅctoｒnuclease ｓ，TALEN）技术是可以对基因组进行定点修饰的基因编辑技术，可精确地定位到基因组的某一位点上并剪断靶标DＮA片段从而插入新的基因片段,从而对原基因组进行“编辑”。

ＺＦN技术依赖于特异性识别并结合DNA的锌指蛋白和FokI核酸内切酶可剪切结构域组成的融合蛋白，可切割特异ＤＮA序列并引起ＤNA双链断裂（ｄoublｅ—strand breakｓ，DＳB），DSB激活细胞的DNＡ修复机制,从而定点修饰基因组。TAＬEN是由转录激活因子样效应物（TALE）代替ZF与ＦｏｋI核酸内切割域组成的基因编辑工具。

一、结构与原理

ZＦN技术中，锌指结构域通常由3－６Cys2—His2型锌指单元串联而成,他们借助一个Ｚn２+形成ββα构象,其中α螺旋中的—1,+3，+6位的三个氨基酸直接与靶DNA的三联碱基相互作用.这三个残基中的任一残基的改变都会影响ZF 对目标碱基的识别。根据目的基因设计8－10个锌指结构域并与FokI结合可构成靶向特定位点的ＺFＮs,在FｏkI切割域的二聚化作用下完成对目的基因的编辑.

ＴAＬＥ蛋白包括三部分：Ｎ端序列、C端序列、由高度保守的重复单元组成的中心重复区。每个重复单元中除12、1３位氨基酸可变外其余几乎相同,1２、1３位的两个氨基酸被称为重复可变的双氨基酸残基(repeat vａrible dｉ-resｉdue ｓ,RＶDs）。ＲＶD与A、T、C、G之间有着严格的对应关系，即NＩ—Ａ；NG-T；HD－C；ＮN—Ｇ。构建TALE时，根据靶DNA序列变换ＲVDs并串联重复单元并与FoｋI切割结构域结合，TＡLE与靶位点结合，二聚化的ＦｏkＩ对其进行切割，完成基因编辑操作.

二、ZFN、TＡLEN异同点比较

与ZFN相比,TAＬＥN的优势是十分明显的。第一,TAＬEN简化了ＺFN复杂的筛选过程，在简单的分子克隆条件下就可构建出高效的TＡLEN；第二,TＡLEN结合DＮA序列更为严格，打靶效率高于ZFN；第三,TＡLEN降低了脱靶

的可能性，从而降低了对受体细胞的毒性。详细比较如下：

２。1共同点

1.二者均为人工改造的核酸内切酶，由特异性识别靶DNA的识别域和非特异

性剪切dsDNA的切割域，他们配合着行使功能,缺一不可。

2.ＺＦＮ、ＴＡLＥＮ中的FｏkI是源于黄单胞杆菌的一种限制性核酸内切酶，

它只有形成二聚体时才对dsＤNA具有剪切活性。

3.FokI切割DNA后的修复机制相同：在两个靶位点之间剪切DNA，在DSＢ

处诱发DＮA的同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制，从而达到定点修饰。

2．2不同点

1.开发时间：最早的ＺＦＮ出现在１８年前,而TAＬＥN技术才于2007年问世.

2.靶DNA序列的识别：ZF结构域识别的是三联碱基，而TALＥN结构域识别

的是某特定的核苷酸。例如：某蛋白包括两个锌指结构域,可识别六个碱基;

而当它包括两个TALＥN结构域时即两个RVD，仅能识别两个碱基.此外，ＴＡＬEＮ的RVD与碱基之间的对应关系与物种、细胞、ＤＮA序列无关,并且设计简单,成本低,与ＺFN相比活性更高。

3.上下文依赖效应:ＺFN在识别ＤＮA序列时,重复氨基酸之间会产生相互作用,

也就是上下文依赖效应,从而使得识别的特异性发生了改变,影响基因修饰效率.还未见TALEN上下文依赖效应的相关报道。

4.对细胞的毒性效应：锌指酶切割DNA时易产生脱靶现象,对细胞产生了毒副

作用。TＡLEN脱靶情况较少,毒性小。例如：通过点对点地比较二者对人细胞内源基因CCR5的删除效果，发现在效率大体相同的情况下,目前实验数据显示TALE所产生的细胞毒性比ZFN小得多。

5.靶向基因序列长度:与ZＦN相比，TALEN可以识别更长的靶基因序列。

三、存在的问题与展望

目前,ZＦN技术还存在以下困惑:锌指蛋白结构域与DNA结合的特异性、亲和性有待提高；如何让解决ZFN的高效导入、可调控切、瞬时表达问题;ＺFN 对细胞的潜在综合作用需进行综合评价，并对引起的潜在免疫反应,尤其是针对

于源于细菌的ＦｏｋI结构域的客观评价。

同样地，TALEＮ技术还存在以下问题:设计识别２0个碱基含有1000多个氨基酸的TALEN蛋白，会引起机体的免疫应答,降低了其在细胞中的打靶效率；TALEＮ同样会产生脱靶的现象，可能由于细胞中染色体的状态引起,如ＴＡLE Ｎ技术对于异染色质化的基因无效；ＴＡＬEN技术的应用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段基因的插入尚不明确。

ＺFN、TAＬEＮ技术为人们定向改造基因提供了基础，但相关应用还处于初级阶段，但他们在转基因动、植物的研究方面尤其是TAＬＥN技术在基因治疗上仍然显示出了巨大的应用价值。2012年Scieｎｃｅ在评述中把TAＬＥN 称为基因组的“巡航导弹”,还大胆预测ＴALEN技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能。

一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。

1、基因学说的创立

孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论,揭示了在染色体上基因的线性排列.

2、DＮA是遗传物质

从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了ＤＮA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DＮA是遗传物质。

3、DNA是基因的载体

4、基因是细胞中ＲＮA及蛋白质的“蓝图”。

5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。

6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展,人们对基因的分子结构有了进一步的认识。

7、随着操纵子模型的提出,人们对基因的表达调控有了进一步的认识。

8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、ｃDＮA文库、分子探针、PCＲ等技术不断被人们运用。

9、目前，不仅能够分离天然基因,还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。

基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科,它的创立和发展,直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步,基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。

二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用.

1、三大理论基础：

（1）1940年艾弗里（Ｏ。Ａvery)等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNＡ可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌;

(2）1９50年沃森(J。Ｄ。Watｓon)和克里克（Ｆ.Cｒicｋ）发现了ＤNＡ分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理;

(３）１960年关于遗传信息中心法则的确立。

2、三大技术条件:

(１）限制性内切核酸酶和ＤNA连接酶的发现;

（2)基因工程载体；

（3)大肠杆菌转化体系的建立。

3、应用：

通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制,为基因工程的后续研究提供基础材料。

三、什么是植物基因工程?什么是转基因植物?两者的关系如何?转基因作物对社会和经济发展的意义主要有哪些?

1、植物基因工程：用人工的方法，从不同生物中提取外源基因片段及载体ＤNA,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法，把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的，此种过程即称为植物基因工程。