基因克隆原理及实验介绍
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390bp 390bp 390bp
1854bp 1854bp 1854bp
859bp 859bp 859bp
336bp 336bp 336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
备注 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变
中间有 2个位点突变
不配对 双峰
中间有 1个位点突变
测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通
需要重新设计引物，直接 pcr 需要重新设ห้องสมุดไป่ตู้引物，直接 pcr 需要重新设计引物，直接 pcr
需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验
PCR 做不出来 PCR 做不出来 PCR 做不出来
中间有 4个位点突变
前后有数个位点突变 前后有数个位点突变 前后有数个位点突变
中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变
中间有 1个位点突变 没有突变 没有突变
结果 成功 成功 成功
成功
失败 失败 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
长度 1854bp 1854bp 1854bp
381bp 381bp 381bp
744bp 744bp 744bp
450bp 450bp 450bp
2700bp
1485bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
? 复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点
失败 失败 失败
成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
目的基因 NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS4A+2K-1 NS4A+2K-2 NS4A+2K-3
NS5-3
E
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
失败 失败 失败
PCR做不出来
无信号，取消测序 没有突变 没有突变
失败
失败 成功 成功
分子生物学
分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其 规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子， 其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传 递中的作用和作用规律。
E.coli制备
转化、培养
测序
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物设计
? 从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）
? 获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
? 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
? 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
与克隆载体 连接
感受态
基因克隆原理及实验介绍
The principle and experiment of gene cloning
中药教研室
内容概要 ? 实验进展汇报（5.10~8.24） ? 基因克隆基本原理及实验操作
目的基因 NS1-1 NS1-2 NS1-3
NS2A-1
NS2B-1 NS2B-2 NS2B-3
NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS5-1 NS5-2 NS5-3
E-3
Cap-1 Cap-2 Cap-3
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
长度 1056bp 1056bp 1056bp
654bp
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
备注 有 2个突变 有 2个突变 有 2个突变
没有突变 没有突变 没有突变
有 2个突变 有 3个突变 有 2个突变
结果 成功 成功 成功
成功 成功 成功
1854bp 1854bp 1854bp
859bp 859bp 859bp
336bp 336bp 336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
备注 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变
中间有 2个位点突变
不配对 双峰
中间有 1个位点突变
测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通
需要重新设计引物，直接 pcr 需要重新设ห้องสมุดไป่ตู้引物，直接 pcr 需要重新设计引物，直接 pcr
需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验
PCR 做不出来 PCR 做不出来 PCR 做不出来
中间有 4个位点突变
前后有数个位点突变 前后有数个位点突变 前后有数个位点突变
中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变 中间有 3个位点突变
中间有 1个位点突变 没有突变 没有突变
结果 成功 成功 成功
成功
失败 失败 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
长度 1854bp 1854bp 1854bp
381bp 381bp 381bp
744bp 744bp 744bp
450bp 450bp 450bp
2700bp
1485bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
? 复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点
失败 失败 失败
成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
目的基因 NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS4A+2K-1 NS4A+2K-2 NS4A+2K-3
NS5-3
E
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
失败 失败 失败
PCR做不出来
无信号，取消测序 没有突变 没有突变
失败
失败 成功 成功
分子生物学
分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其 规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子， 其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传 递中的作用和作用规律。
E.coli制备
转化、培养
测序
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物设计
? 从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）
? 获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
? 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
? 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
与克隆载体 连接
感受态
基因克隆原理及实验介绍
The principle and experiment of gene cloning
中药教研室
内容概要 ? 实验进展汇报（5.10~8.24） ? 基因克隆基本原理及实验操作
目的基因 NS1-1 NS1-2 NS1-3
NS2A-1
NS2B-1 NS2B-2 NS2B-3
NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS5-1 NS5-2 NS5-3
E-3
Cap-1 Cap-2 Cap-3
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
长度 1056bp 1056bp 1056bp
654bp
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
备注 有 2个突变 有 2个突变 有 2个突变
没有突变 没有突变 没有突变
有 2个突变 有 3个突变 有 2个突变
结果 成功 成功 成功
成功 成功 成功