苹果感染炭疽病菌后6 种酶活性的变化

安徽农业大学学报，２００４，３１（１）：４６～５０

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

苹果感染炭疽病菌后６种酶活性的变化①

吴芳芳１，２，檀根甲１倡

（１畅安徽农业大学植保系，合肥２３００３６；２畅南京气象学院环境科学系，南京２１００４４）

摘　要：由于炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）的侵染，苹果果实体内多酚氧化酶（ＰＰＯ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、几丁质酶、β唱１，３葡聚糖酶和果胶酶活性均有不同程度地提高。活性的较大幅度提高时期与病症出现的时期一致。在炭疽菌感染苹果过程中，从感染部位到未感染区域的边缘，ＰＡＬ活性有一个明显的下降梯度。β唱１，３唱葡聚糖酶活性变化时程与几丁质酶活性变化时程一致。病原菌侵染果实后，果胶甲酯酶（ＰＥ）的活性升高，同时果胶分解、果实组织的衰老也能促进ＰＥ活性的提高。

关键词：苹果炭疽菌；过氧化物酶，多酚氧化酶，苯丙氨酸氨酶，几丁质酶，β唱１，３葡聚糖酶，果胶酶 中图分类号：Ｓ４３２畅２２文献标识码：Ａ文章编号：１６７２唱３５２Ｘ（２００４）０１唱００４６唱０５

苹果炭疽病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）是苹果的三大病害之一，由于其潜伏侵染特性，不仅在田间产生危害，还可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害。采后腐烂已是生产中的突出问题，过去对果实病害的研究主要集中于生长期病害，而对贮藏期的病害研究较少。近年来研究证明活性氧在植物抗性机制中起重要作用［１～４］，而植物体内活性氧的产生是一系列代谢酶调控的［５，６］。在病害发生发展过程中，生物活性酶活性的变化一定程度上反应了寄主与病原互作关系，苹果采后炭疽病发生发展与生物活性酶的关系尚少见报道。为此，本研究测定了接种不同时间内ＰＰＯ、ＰＯＤ、ＰＡＬ、几丁质酶、β唱１，３葡聚糖酶与果胶酶活性的变化，为研究苹果对采后炭疽菌产生的抗性机制中酶活性所起的作用奠定基础。

１　材料与方法

１畅１　供试菌株

供试苹果炭疽菌菌株ｃｇｌ由安徽农业大学植保系植物病理教研室提供。

１畅２　供试苹果

红富士品种苹果从合肥市周谷堆水果批发市场购买。

１畅３　酶活性测定方法

选择大小一致、健康的红富士苹果，用自来水冲洗后晾干，再经７５％酒精表面消毒和紫外线照射５ｍｉｎ。用苹果炭疽菌孢子悬浮液（浓度为１×１０５个・ｍＬ－１）针刺接种于果实一侧（另一侧保持完整），２５℃贮藏。取病斑组织和距离病斑１、３、５、７、１０ｍｍ及病斑对面健处的苹果组织，测定生物酶的活性。

１畅３畅１　过氧化物酶（ＰＯＤ）活性的测定　参照张宪政等［７］（１９８９）的方法，测ＯＤ４７０值。单位是Ａ４７０ｍｉｎ－１・ｇ－１ｍｆ。

１畅３畅２　多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性的测定　按照Ｍｏｚｚｅｔｔｉ等［４］（１９９５）的方法测定酶活性，测定ＯＤ４１０值。以３畅０ｍＬ不含邻苯二酚的缓冲液加相应酶液做参比，单位是Ａ４１０ｍｉｎ－１・ｇ－１ｍｆ（鲜重）。

１畅３畅３　苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性的测定　接种后不同时间取苹果组织，切成小块，称取重量５ｇ，在冰浴中用２倍体积的０畅１ｍｏｌ・Ｌ－１、ｐＨ８畅８硼酸缓冲液（内含１５ｍｍｏｌ・Ｌ－１巯基乙醇、０畅５％抗坏血酸和１００ｍｇＰＶＰ）匀浆，１２０００ｇ离心２０ｍｉｎ，取上清液。反应液为１畅６ｍＬ、０畅１ｍｏｌ・Ｌ－１硼酸缓冲液（ｐＨ８畅８，内含

①收稿日期：２００３唱０５唱１３

基金项目：安徽省跨世纪学术与技术带头人资助项目和安徽省自然科学基金项目（０３０４１４０４）资助。

作者简介：吴芳芳（１９７３—），女，讲师。倡通讯作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ）

１０ｍｍｏｌ・Ｌ－１苯丙氨酸）加０畅２ｍＬ酶液，３８～４０℃反应１ｈ后，加入０畅２０ｍＬ、６ｍｏｌ・Ｌ－１ＨＣｌ终止反应，测ＯＤ２９０值，以反应时间零作参比。ＯＤ２９０变化０畅０１为一个酶单位（Ｕ・ｈ－１・ｇ－１ｍｆ）。

１畅３畅４　果胶甲酯酶（ＰＥ）的测定　果胶的制备：称２ｇ果胶粉加热溶解，煮沸，冷却，过滤，定容至１００ｍＬ，用０畅２ｍｏｌ・Ｌ－１ＮａＣｌ稀释至１％。

将苹果炭疽菌在液体培养基中，２５℃恒温震荡培养，取不同生长时期的菌体，经过滤和多次无离子水冲洗除弃培养液，得苹果炭疽病菌菌丝体，测定其果胶甲酯酶的活性。取果实组织用１０％ＮａＣｌ研磨，过滤，离心，上清液ｐＨ值调至３～４。取２０ｍＬ内含０畅１ｍｏｌ・Ｌ－１ＮａＣｌ的１％果胶溶液，将ｐＨ调至７畅５，放置３０℃恒温水浴中，加０畅１ｍＬ酶液，立即将ｐＨ调到７畅５，开始计时。每隔一定时间加ＮａＯＨ溶液，使混合液的ｐＨ保持在７畅５，３０ｍｉｎ内所加的ＮａＯＨ的摩尔数就是酶作用后释放出的游离羧基的摩尔数。酶单位：在３０ｍｉｎ释放出１ｍｍｏｌ・Ｌ－１的ＣＨ３Ｏ－定为一个酶单位。

１畅３畅５　几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性的测定　酶液抽提：取接种后不同时间的苹果组织，切成小块，称取重量５ｇ，在４℃下，用２倍体积０畅５ｍｏｌ・Ｌ－１醋酸钠缓冲液ｐＨ５畅２（内含１５ｍｍｏｌ・Ｌ－１巯基乙醇）中匀浆后，在４℃下１２０００ｇ离心２０ｍｉｎ，取上清液，再在４℃下１２０００ｇ离心６０ｍｉｎ，取１２００μＬ上清液。用４倍体积丙酮在－２０℃下沉淀后，离心，取沉淀物。用预冷的丙酮洗２次后，减压干燥，用０畅５ｍｏｌ・Ｌ－１醋酸钠缓冲液溶解（ｐＨ５畅２）。用几丁质粉（ｓｉｇｍａ产品）制备含量为１５ｍｇ・ｍＬ－１的胶体几丁质，４℃保存。

酶活性测定：反应液中含０畅５ｍＬ酶液，１０μＬ，１ｍｏｌ・Ｌ－１醋酸钠缓冲液（ｐＨ４畅０），０畅３ｍｍｏｌ・Ｌ－１叠氮钠（ｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ）和０畅２ｍｍｏｌ・Ｌ－１胶状几丁质，３７℃水浴中反应２ｈ后，１０００ｇ离心３ｍｉｎ终止反应。取上清液０畅５ｍＬ，加３０μＬ、１ｍｏｌ・Ｌ－１磷酸钾缓冲液（ｐＨ７畅１）和２０μＬ浓度为１５ｍｇ・ｍＬ－１脱盐的蜗牛酶溶液（为了水解几丁质低聚物），继续在３７℃水浴中反应１ｈ。加０畅１ｍＬ磷酸钠缓冲液（ｐＨ７畅１），沸水中煮３ｍｉｎ，冷却后，再加２ｍＬ１％对甲氨基苯甲醛溶液，３７℃中保温２０ｍｉｎ后，测定ＯＤ５８５值。用Ｎ唱乙酰葡萄糖胺作标准曲线，以反应时间零作参比，一个酶单位定义为１ｓ释放出１ｍｏｌＮ唱乙酰葡萄糖胺所需要的酶量。

１畅３畅６　β唱１，３唱葡聚糖酶（β唱１，３唱ｇｌｕｃａｎａｓｅ）活性的测定　按几丁质酶液提取方法提取β唱１，３唱葡聚糖酶的酶液。以昆布多糖还原释放出的还原糖量测定该酶的活性。１００μＬ酶液加１３０μＬ含量４％的昆布多糖，４０℃反应１ｈ，然后加３００μＬＤＮＳ试剂终止反应，沸水浴煮５ｍｉｎ，冷却后加５畅４ｍＬ去离子水，混匀，测ＯＤ５００值。以反应时间零作参比，一个酶单位定义为６０ｓ内还原昆布多糖中释放出１ｍｏｌ葡萄糖量所需的酶量。

２　结果与分析

２畅１　过氧化物酶（ＰＯＤ）活性的变化

接种炭疽菌后，苹果果实中过氧化物酶（ＰＯＤ）活性明显升高，接种后４～５ｄ提高幅度较大（图１）。

而同一果实中接种３ｄ后，病斑直径为１ｃｍ时，距病斑１、３、５、７、１０ｃｍ处的苹果组织

ＰＯＤ活性与对照相

图１　接种炭疽病菌后苹果组织中ＰＯＤ活性的变化Ｆｉｇｕｒｅ１　ＣｈａｎｇｅｓｏｆＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｐｐｌｅｆｒｕｉｔａｆｔｅｒｉｎｏｃ唱ｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＣ畅

ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ

图２　距病斑不同距离处的ＰＯＤ活性的变化

Ｆｉｇｕｒｅ２　ＣｈａｎｇｅｓｏｆＰＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｐｐｌｅｆｒｕｉｔｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒ唱ｅｎｔｄｉｓｔａｎｃｅｓｆｒｏｍｌｅｓｉｏｎ

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３１卷１期吴芳芳等　苹果感染炭疽病菌后６种酶活性的变化