【周凌云】茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

周凌云王沅江黄安平曾振刘红艳

（1湖南省茶叶研究所，长沙410125）

摘要：根据茶炭疽病菌与其它菌ITS序列的差异设计了1 对寡聚核苷酸引物，并优化DNA 抽提方法与扩增条件，从而实现了病叶准确而快速的PCR 检测。分离到两种病原菌Z1、Z2通过形态鉴定与回接实验初步鉴定为茶炭疽病菌，并在核酸体转录间隔区序列（GITS、ITS）及肌动蛋白基因（ACT）3对引物的多基因分子联合检测实验中再次被证实。

关键词：茶炭疽病；分子检测；病原；鉴定；症状

Molecular Detection and Pathogen Identification of

Tea Anthrax

ZHOU Lingyun, WANG Yuanjiang, HUANG Anping,ZENG Zhen,LIU Hongyan

Hunan Tea Research Institute，Changsha 410125

Abstract：According to the sequence of internal transcribed spacer regions ( ITS) of the ribosomal gene，a pair of specific primers for the pathogen of Tea anthracnose was synthesized．With the optimization of reaction conditions and amplification Study,we provided a accurate and rapid method to detect the pathogen. Z1、Z2 were isolated and been preliminary identified as two different pathogens of tea anthracnose by morphological identification and tie back experiment,The conclusion was testified again by molecular detection of three primes(General ITS, ITS and Actin gene gene).

Key words: Tea anthracnose；Molecular detection；Pathogen；Identify；Symptom

基金项目：湖南省农业科学院创新项目

作者简介：周凌云（1978—），女，湖南邵阳人，助理研究员，博士研究生，主要从事茶树病害研究，zhoulingyun0808@

茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到及时高效的防控，自2009年，本研究组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后[1]，再次进行自然病样的直接分子检测，并分离获得两种菌落形态差异很大的病菌，分别命名为Z1、Z2，经过形态学与分子鉴定明确Z1、Z2为茶炭疽病的致病菌。

1 材料与方法

1. 1供试病叶及来源

长沙县茶园随机采集20片显症为红褐色病斑的茶叶与20片显症为灰白色病斑的茶叶。

1.2 病原菌分离、回接与形态学观察

选取病叶病健交界处组织100块，约2mm×2mm，75%酒精中浸泡5秒钟，3%次氯酸钠溶液灭菌1分钟，无菌水洗3次，置于PDA培养基上，放入28℃培养箱中培养，单孢分离得到纯孢子培养于PDA上，记录病原菌的菌落形态、分生孢子的形状、颜色、大小等。

借鉴Yoshida，K，2004[2]的接种方法，利用打孔器将PDA上培养5天的菌落打成菌碟，置于挑针戳了2个伤口的茶叶上，脱脂棉蘸无菌水保湿，分别接种于室内的ROOTCUBES®生长介质(Smithers-Oasis有限公司)中保持高湿、26℃与田间枝条茶叶上用保鲜袋连续保湿3天，设置3个重复，对照接无菌培养基，其他操作相同，每天观察1次发病情况，将已产生症状的叶片进行切片棉兰染色观察。

1.3 病原菌分子生物学鉴定

根据茶炭疽病菌与其它菌属ITS序列的差异，应用DNAStar的PrimerSelect 设计了1个ITS引物对，与来自文献[3-4]的GITS 、ACT的这2个引物一起交付华大生物有限公司合成，3个引物对见表1。

表1 选择的目标基因及相应的引物

分别应用TIANGEN公司植物基因组DNA抽提试剂盒与真菌基因组DNA试剂盒提取自然发病叶片的DNA，而对于Z1、Z2的DNA抽提则采用其真菌基因组DNA 试剂盒。

以提取的DNA为模板，用3对引物扩增DNA序列，利用宝生物公司pMDTM19-T 载体进行PCR产物的克隆，方法参照pMDTM19-T载体说明书。选择插入片段长度与克隆片段长度一致的克隆，送交华大生物公司测序分析。将测定所得序列利用Blast程序从GenBank搜索相关序列，进行同源性比较。

2结果与分析

2. 1 明确两种茶炭疽病症

茶炭疽病主要发生在茶树成叶或老叶上，病斑近圆形或不规则形，初期水渍状暗绿色，最后呈红褐色或灰白色，病斑上生有细小的黑色粒点，病斑可扩大到叶片的1/2以上，病健分明，见图1A、1B。

图1A 茶炭疽病红褐色病斑图1B 茶炭疽病灰白色病斑

2．2 分离到两种病原菌

100块红褐色病样分离到Z1的几率为50.00%、Z2为5.12%，100块灰白色病样分离到Z1的几率为73.33%、Z2为3.20%。Z1在PDA上生长速率平均为1.82cm/d,菌落颜色逐渐由白色转变为灰白直至灰黑。显微镜下菌丝体附着胞黑褐色，棍棒状、掌状或三角形，边缘整齐，大小为(8-12)um×(7-20)um，见图2A、2B。Z2在PDA上生长速率平均为1.25cm/d。菌落红褐色，后期菌落表层长出一些黄色及白色絮状物，20天左右可形成分生孢子，分生孢子单胞、无色、壁光滑，圆柱形，两端钝圆，有油球，大小为(15-24 )um×(8-12)um。而由病原菌的形态特征初步鉴定Z1、Z2均为茶炭疽病原菌，见图3A、3B。