苹果酸乳酸发酵对苹果酒风味的影响

苹果酸乳酸发酵对苹果酒风味的影响
摘要：苹果酸-乳酸发酵( 简称MLF)是现代葡萄酒、苹果酒酿造工艺中非常重要的二次发酵过程。

葡萄酒、苹果酒经过苹果酸乳酸发酵以后, 原有的酸涩和粗糙感降低, 而变得柔和、圆润且具有果香味。

文中根据国内外研究成果, 分析总结了苹果酸乳酸发酵的机理及苹果酸- 乳酸发酵对苹果酒风味的影响。

关键词: 苹果酸乳酸发酵(MLF) ; 苹果酒; 风味
苹果酸乳酸发酵( malolactic fermentation, 简称MLF)是葡萄酒、苹果酒酿造中非常重要的二次发酵过程。

在葡萄酒的酿造过程中, 苹果酸乳酸发酵不仅可降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感, 使之柔和、圆润, 而且还提高了葡萄酒的感官质量和生物稳定性, 所以许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒都要进行苹果酸乳酸发酵[1]。

北方地区气候寒冷, 苹果酸度较高, 酿造出的苹果酒口感较酸涩, 需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。

相反, 南方地区苹果酸度较低, 有些酿酒师并不提倡进行苹果酸乳酸发酵, 所以目前更多的酿酒师考虑的是苹果酸乳酸发酵对葡萄酒、苹果酒风味的贡献。

近年来, 国外主要集中在( 1) 发酵剂的研发; ( 2) 细胞固定化以及酶反应器的开发与应用; ( 3) 分子生物学角度研究苹果酸乳酸酶。

对于苹果酒的酿造, 目前国内采用的苹果品种主要是红富士,酸度处于中等水平, 所以根据我国苹果品种的特点, 不能让苹果酸乳酸发酵仅仅停留在降酸的层次上, 更多的应考虑苹果酸乳酸发酵对风味的改善。

1 苹果酸- 乳酸发酵的机理
1. 1 苹果酸- 乳酸发酵的途径
苹果酸- 乳酸发酵是在酒精发酵结束后, 在乳酸菌的作用下, 将L- 苹果酸( 二元酸) 转化为L- 乳酸( 一元酸) 和CO2的过程。

1. 2 苹果酸- 乳酸发酵生产中的乳酸菌
在苹果酒中发现的乳酸菌主要有三类：酒球菌属（Oenococcus )、片球菌属（Pediococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）[2]。

苹果酒中发现的乳酸菌见表1。

表1 苹果酒中发现的乳酸菌
Table 1 Lactic Acid Bacteria Found in Cider
乳酸菌名称拉丁名称细菌种类
肠膜明串珠菌乳糖亚种Leuconostoc
Mesenteroides
subsp. lactosum
异型发酵球菌
酒类酒球菌Leuconostoc
oenos 异型发酵球菌
啤酒片球菌Pediococcus
cereviae
同型发酵球菌
植物乳杆菌Lactobacillus
plantarum
同型发酵杆菌
1.3用乳酸菌启动MLF对苹果酒的影响
自发的苹果酸-乳酸发酵在触发和发酵时间上是不确定的，通过添加人工培养的乳酸菌能确保获得良好的发酵效果。

采用这种方式不仅可以在短时间内结束苹果酸-乳酸发酵，并能通过乳酸菌形成的特定的风味物质来控制苹果酸-乳酸发酵的质量，使口感柔和、增加果香和香气的复杂性。

2 影响乳酸菌启动苹果酸-乳酸发酵的因素
乳酸菌的营养条件及接种量、发酵温度、酒精度、pH值、SO2含量、氧含量和其他微生物会影响乳酸菌的生长，从而进一步影响苹果酸-乳酸发酵的进行。

国内近年来对于葡萄酒和苹果酒的苹果酸-乳酸发酵进行了一系列的研究，很多针对葡萄酒进行的研究对于苹果酒的生产也有实际的指导意义和重要的参考价值。

2.1 乳酸菌的营养条件
刺激乳酸菌诱导苹果酸-乳酸发酵的典型营养物包括微量元素、氨基酸、多肽、维生素和其它生长因子。

乳酸菌代谢所必需的矿质元素包括Mn2+、Co2+、Zn2+、Mg2+；精氨酸、血红素、硫胺素和泛酸对于乳酸菌的生长也具有促进作用。

在发酵之前在苹果浓缩汁中添加200mg/L磷酸氢二铵和0.3mg/L硫胺素能够得到高品质的苹果酒[3]。

2.2 酒精度
酒精度是乳酸菌在苹果酒中生长的重要抑制因子, 酒精浓度过高会对乳酸菌的新陈代谢产生抑制作用，不同菌株对酒精的耐受性存在差异。

表2 酒精度对MLF的影响
Table 2 The Effects of Alcohol on MLF
酒精度对MLF的影响
≥6%MLF过程受到影响
≥10%酒精就会变成阻碍乳酸菌生长的重要因
子，是人工接种的主要障碍，从而抑制MLF
的顺利进行
12% 对乳酸菌群的前期增长有强烈的抑制作
用，同时造成乳酸菌的大量死亡，MLF很
难发生
≥14%几乎所有细菌的耐酒精度都为零，MLF不
启动
酒精度是通过影响苹果酸分解酶活力来间接影响MLF。

乙醇会影响细菌细胞质膜的通透性而造成对细胞生长和发酵必须的辅酶因子和离子的流失从而影响细菌的活力。

但苹果酸-乳酸细菌对乙醇的耐受力有较大的差异,生产上可以通过筛选耐受乙醇的菌株或者添加8%乙醇进行驯化以提高酒精抗性。

2.3 二氧化硫
二氧化硫对乳酸菌也是一个强烈的抑制因子，二氧化硫能够强烈抑制ATP 酶的活性，使之降低到37%～58%[4]。

苹果酒中的二氧化硫有结合二氧化硫、游离二氧化硫等存在形式，游离二氧化硫比结合二氧化硫对乳酸菌作用强，二氧化硫对MLF的抑制作用取决于使用的乳酸菌菌种、苹果酒的pH值以及酒中存在的可溶性固形物含量。

应当根据苹果酒本身的情况、发酵温度和pH值，适当添加二氧化硫。

表3 二氧化硫对MLF的影响
Table 3 The Effects of Sulfur Dioxide on MLF
二氧化硫浓度对MLF的影响
10～25mg/L 对苹果酸-乳酸细菌群体生长影响不大，MLF可正常
进行
≥50mg/L MLF就会明显推迟
≥100mg/L 抑制发酵醪中乳酸菌繁殖，MLF几乎不能进行
低的pH与二氧化硫抑制作用有协同效应，原因是低的pH可以使结合态的二氧化硫向游离态转化，使游离态二氧化硫浓度增大，形成对苹果酸-乳酸细菌的杀伤。

二氧化硫虽能抑制细菌生长，但在正常苹果酒生产条件下，可接受的二氧化硫浓度本身并不足以完全抑制乳酸菌的活动。

二氧化硫的加入量对苹果酒的香气也有重要影响。

Jarvis等发现，当存在过量的二氧化硫（游离Cso2>30mg/L）时，一些酵母会产生大量的双乙酰，对苹果酒的风味产生不利影响[5]。

压榨后立即加入二氧化硫比压榨后12-24h加入二氧化硫所生产的苹果酒香气纯净，推迟加入则使野生酵母和细菌生长，产生一定的“青草味”。

因此，二氧化硫的加入量应尽量少，并在果汁压榨后或压榨过程中及时加入。

2.4起始pH值
发酵速度同最初的pH值有很大的关系，最初pH值高0.2个单位，其发酵速度会高许多。

起始为中度pH值时，可滴定酸降低最快。

所以通过控制发酵液的酸度，可以很方便地控制苹果酸-乳酸发酵[6]。

表4 起始pH值对MLF的影响
Table 4 The Effects of Initial pH Value on MLF
p H值对MLF的影响
pH＜3 低pH本身不能保证完全阻止乳酸菌生
长，但在低温条件同时存在时，可以抑制
苹果酸-乳酸发酵的进行
3.2～3.5 pH值越高，MLF就越容易
≥4易被其它微生物感染
糖在pH值3.6时比在3.0时更易于被苹果酸-乳酸细菌分解，造成挥发酸的升高。

这与在较高的pH值下进行MLF乙酸含量较高是相一致的。

Maicas发现pH对苹果酒的香气有很大的影响，pH为3.0-3.5时，苹果酒的高级醇和酯类含量较低，香气更纯净、果香味更浓[7]。

2.5发酵温度
温度常常是苹果酒MLF的决定性因素。

苹果酒的酒度越高，pH值越低，则
温度的影响就更严重。

表5 发酵温度对MLF的影响
Table 5 The Effects of Fermentation Temperature on MLF 温度对MLF的影响
5～10℃可阻止MLF
＜15℃苹果酸-乳酸细菌生长缓慢
15-30℃苹果酸-乳酸发酵随温度的升高发生速度加快，同时结束得
也越早
>30℃苹果酸-乳酸细菌生长缓慢，最高生长温度为35℃，致死温
度为60℃(1～2 min), 虽然苹果酸-乳酸发酵迅猛进行，但会
给苹果酒造成缺陷
Pollard采用不加酵母，用二氧化硫处理过的果汁，在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃和35℃下完全发酵，分析了各种发酵温度下苹果酒中高级醇形成量。

发现发酵温度对苹果酒的高级醇生成量影响较大，高级醇在15-25℃之间含量较高且趋于恒定，在此温度范围外迅速下降。

Leguerinel等研究了8℃和18℃两种发酵温度对苹果酒风味的影响，8℃生产的苹果酒中乙酸、乙醛、乙酸乙酯比18℃时高或接近；醇类中，正丙醇比18℃时高，异丁醇、戊醇、2,3-丁二醇则低。

与原料和酵母相比，发酵温度是影响戊醇、异戊醇形成的主要因素[8]。

2.6 CO2和氧
CO2对乳酸菌的生长有促进作用，所以发酵后延长酒液与酒脚接触的时间有利于保持CO2含量，可刺激苹果酸-乳酸细菌的生长，容易发生苹果酸-乳酸发酵。

一般苹果酸-乳酸细菌为兼性厌氧微生物，它们的生存和生长需要低浓度的氧；但多数场合溶解氧浓度的增加会增加对苹果酸-乳酸发酵的抑制作用。

氧浓度或氧化还原电位一般在300～500 mV ,但会受溶解CO2和倒罐时通气状况的影响而发生变化。

总的来说，发酵过程通风有利于进行MLF[9]。

2.7其他的微生物
接种的乳酸菌会与其他细菌（pH条件有利于其生存生长）相互作用。

这些细菌会产生细菌素（如对乳酸菌有毒害作用的多肤或蛋白质），严重阻碍MLF 的进行。

酵母菌与乳酸菌之间存在的拮抗作用主要通过对营养物的竞争和分泌抑
菌物质（如二氧化硫、中链脂肪酸或分子量为5-10KDa多肽物）来实现。

这种抑菌效应取决于酒体中天然存在脂肪酸的含量，较低pH会增强拮抗作用。

3 乳酸菌和苹果酒风味的关系
3.1苹果酒风味组成的研究现状
构成苹果酒香气的物质主要为挥发性地酯类、醇类以及一些脂肪酸。

随着科技的发展，苹果酒将研究许多新兴的分析检测技术用于苹果酒风味成分的研究。

Roberto等还利用吹扫捕集-气质联用技术对苹果酒中的49种化合物进行了分离和鉴定，并通过对9种酯类化合物进行了回收率和精密度的检测，回收率在93%（癸酸乙酯）~117%（3-甲基丁酸乙酯）之间，精密度为2.2%（乙酸己酯）~ 10.9%（乙酸异戊酯）。

由于该方法不需要对苹果酒样品进行繁琐的前处理，因此可作为苹果酒分析检测的有效工[10]。

岳田利等利用顶空法固相微萃取与气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC/MS）测定了12种苹果酒中的部分重要香气成分，利用主成分分析法建立了苹果酒香气质量评价模型，为苹果酒香气的评价探索了一种新的途径[11]。

韩业慧等用搅拌棒吸附萃取出了苹果酒中80种挥发性物质，包括37种酯类物质、16种醇类物质、9种酸类物质、8种萜烯类化合物以及内酯类化合物和酚类物质[12]。

但是，苹果酒中仍有大量的香气成分没有定性，一些挥发性物质的呈香特征、香气阈值没有确定，使人们难以确定对苹果酒香气影响最重要的化合物，从而难以确定生产某种风格苹果酒的最适酵母、苹果品种和工艺条件，给苹果酒酵母的选育、苹果酒香气的研究及苹果酒产品的开发带来盲目性。

3.2 乳酸菌对苹果酒风味的影响
苹果酸-乳酸发酵在降低苹果酒有机酸的同时能够增加其风味的复杂性。

现在的研究工作更倾向于苹果酸-乳酸发酵对苹果酒风味的改善。

MLF使苹果酒中有机酸的浓度降低。

乳酸菌的苹果酸-乳酸酶催化L-苹果酸转变成L-乳酸和二氧化碳的过程即苹果酸-乳酸发酵最主要的生化过程[26]。

这一转变导致有机酸构成的变化是引起苹果酸-乳酸发酵前后苹果酒口味变化的主要原因之一。

MLF引起苹果酒香气的变化。

苹果酸-乳酸发酵后酒风味的不同，是由于进
行苹果酸-乳酸发酵的不同乳酸菌作用的结果，酒明串珠球菌一般产生所希望的风味变化。

酒类酒球菌和乳杆菌都具有糖苷酶活性，能释放萜烯、降碳倍半萜及其衍生物、酚类和香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）等化合物。

即使乳酸菌没有诱导苹果酸-乳酸发酵进行，糖苷酶活性的存在也能对最终的风味有所贡献。

从感官的角度讲，即使无法对挥发物质和气味的细微差别建立明确的联系，但乳酸菌的存在能使苹果酒风味产生明显的变化这一点是毋庸置疑的[13]。

此外，氨基酸作为风味物质的前体物质，其在MLF前后的变化直接影响着风味物质的浓度。

如：苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸[14]。

表6 苹果酸-乳酸发酵前后苹果酒主要风味构成物质对比Table 6 Main flavor substances contrast before and after malolactic
fermentation in cider
苹果酒MLF对苹果酒的影响
主要特征主要成分为：醇、酯、醛、酮、烃、
萜类和烯烃等，含量在7~17mg/L；
主要芳香成分：2-甲基丁酸乙酯、
乙酸戊酯、己酸戊酯等135种。

苹果酒香气的基本骨架组分：2-苯
乙醇及其酯类以及低级脂肪酸
苹果酸-乳酸发酵后酒风味的不同，是
由于进行苹果酸-乳酸发酵的不同乳酸
菌作用的结果。

酒类酒球菌和乳杆菌
都具有糖苷酶活性，能释放萜烯、降
碳倍半萜及其衍生物、酚类和香草醛
（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）等化合物。

醇类除正丁醇、正戊醇之外，多数的醇
类物质都是在发酵过程中由酵母的
新陈代谢产生的，它们的形成依赖
于酵母的种类以及果汁的化学成
分；
异丁醇、异戊醇、苯乙醇的浓度比
苹果汁中高
异丁醇、异戊醇、4-戊烯-2-醇含量增
幅较大，苯乙醇等浓度有所下降[29]
酯类脂肪酸酯特别是2-甲基丁酸乙酯赋
予苹果酒的苹果香；酯类含量很低，
但香气特征明显；辛酸异戊酯增加，
2-甲基丁酸己酯、己酸丁酯、丁酸
乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸异戊酯三
种酯的浓度随着乳酸、乙酸浓度增加
而升]；己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸丁
酯、丁酸乙酯、甲酸庚酯等也有所上
己酯、辛酸丁酯、己酸己酯、乙酸戊酯、乙酸己酯只存在微量，异丁酸乙酯、丁酸苯乙酯、乙酸苯乙酯同苹果汁相差不多升；辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯等浓度下降。

醛酮类乙醛和双乙酰在苹果酸-乳酸发酵之后会明显升高，适当的双乙酰会提高苹果酒的品质，但过多的双乙酰会给苹果酒带来不良味道。

双乙酰含量不能超过0.6mg/L。

有机酸苹果酸（1.0~14g/L）、奎宁酸
（0.4~5g/L）柠檬酸（<0.2g/L）、柠
苹酸（<0.5g/L）、醋酸、甲酸、丙酸、
乳酸、富马酸等[26]
乳酸、奎尼酸的浓度升高，苹果酸、
琥珀酸下降[28]，柠檬酸被苹果酸-乳酸
菌降解生成醋酸，从而导致挥发酸增
高。

氨基酸苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨
酸、丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、
酪氨酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、
半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷
氨酸、天冬酰胺[31]
苯乙醇和苯丙氨酸的浓度紧密相关，
苯乙醇的浓度在MLF后降低。

亮氨酸、
缬氨酸是生成异戊醇、异丁醇的前体
物质，MLF后异戊醇和异丁醇的浓度
随着亮氨酸、缬氨酸的升高而升高[28]。

4 苹果酒苹果酸-乳酸发酵研究展望
目前酿酒者主要通过在苹果酒中添加酒类酒球菌启动苹果酸-乳酸发酵，从而对苹果酒的风味和口感产生一定的调控作用。

然而，该调控过程能否顺利进行受到温度、pH、酒精度和二氧化硫等发酵条件的影响和调控，因此综合研究这些影响因素对发酵过程和苹果酒感官品质的研究对工业化生产具有非常现实的重要意义。

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