大肠杆菌基因工程人胰岛素

下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
胰岛素AB链分别表达法的基本原理
人胰岛素原表达法
2 将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳 糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍 为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中 高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取 溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后 将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素 原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3 对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得 体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物 活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必 须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的 A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种 克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以 及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。 经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白， 再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融 合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
AB链分别表达法
1 A链和B链的编码区由化学合成，两个双链
小结
上述三种工程菌的构建路线均采用胰岛素或
胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基
1
4.5
因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达
率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含
2
5
体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白
分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原
3
3
编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的
虽然上述工艺路线并不比AB链 分别表达更为简捷，而且需要 额外使用两种高纯度的酶制剂， 但由于其体外折叠成功率相当 高，在一定程度上弥补了工艺 繁琐的缺陷，使得产品的生产 成本仅为50美元/g。
AB链同时表达法
3 这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，
然后组装在大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋 白经溴化氢CNBr处理后，分离传话A-B链多肽，然后再根据两条链连接 处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体 外折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺 陷仍是体外折叠的正确率较低，因此目前尚未进入应用阶段。
本次以重组人胰岛素为例，论述利用大肠杆菌生产外 源基因表达产物的基本过程。
胰岛素的生产方法
人胰岛素是一种由两条多肽链 ( A 链和 B 链) 组成的蛋白 质。胰岛素合成时，最初在胰岛 B 细胞内的附着核糖体上形 成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后， 信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体， 在高尔基体中切除连接 序列( C 链) 形成 A 链和 B 链，然后 通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。
大肠杆菌基因工程 —人胰岛素的生产
讲 述 人 599
小组成员
2016.11.7
目录
1.利用重组大肠杆菌 生产医用蛋白或多肽
2.胰岛素的生产方法 3.产人胰岛白或多肽
由于大肠杆菌繁殖迅速价格低廉，培养代谢易于控制， 因此重组大肠杆菌在医用蛋白的大规模生产中具有重要 的经济意义。尽管有些生物活性严格依赖于糖基化作用 的真核生物功能蛋白无法用重组大肠杆菌进行生产，蛋 白质生物合成后加工系统的缺乏使得某些人体蛋白难以 折成天然构象，但仍有100多种异源蛋白通过大肠杆菌 基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂 的人体蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、 尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）、二硫键共 价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 以及四聚体的血红蛋白(Hb）等。