内生菌多样性

第二章

水稻真菌的分离

1.样品采集

样品采集后用保鲜袋包好，置于保温盒中带回，在采集后4 h内进行处理。每个晶种随机取样10株，每株水稻分别剪成小段，随机选取10个根、叶片剪断进行内生真菌的分离。2培养基

(1)水琼脂(分离植物内生真菌)

琼脂(广东湛江产) 12 g，水1000ml。

（2）PDA培养基(主要用于分离培养植物内生真菌

马铃慧(去皮)200 g 葡萄糖10—20g

蒸馏水1000 ml pH7,0．7．2

固体培养基加入1.6-2.0％琼脂。

以上培养基用于分离时加50 ug/ml氯霉素或50ug/ml硫酸链霉素十50ug/ml氨苄毒霉素一致细菌生长。

2．1植物内生真菌的分离

表面消毒按Schulz et al，(1993)的方法进行。将采集的水稻根、茎叶样品在自来水下冲洗，除去表面附着的尘土与泥沙，晾干。样品先在36％甲醛溶液中表面消毒l min，无菌水冲洗3次。晾干后将样品剪成lcm长片段，各处理均随机选取100个片段平铺于PDA (1.0％琼脂)平板上，加入氯霉素与链霉素各50ug/ml抑制细菌的生长，在26℃培养5—7 d。长出的真菌菌经过几次纯化后保存于PDA斜面上。

取最后一次清洗的无菌水涂布平板,26℃培养14 d后无菌落长出以验证消毒是否完全。

2.2 真菌的鉴定

采用载波片培养法：向无菌栽玻片上滴加一滴PDA琼脂或其他培养基(60℃)，待培养基凝固后，在边缘接入欲鉴定的真菌培养物，盖上无菌盖玻片，移入无菌培养皿中，用塑料袋密封，塑料袋内放入含水纱布，以避免培养基干澡。长出菌丝后，在显微镜下观察，根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)将真菌鉴定至属

2．3内生真菌培养及代谢物提取

分离到的内生真菌斜面培养物经活化后分别接种至100 ml液体PDA培养基，27℃摇床上以160 rpm的转速培养7-10 d后，用纱布过滤分开菌丝体与发酵液，菌丝体用适量丙酮浸泡(没过菌丝体)抽提菌丝体代谢物，将丙酮减压蒸干后，用2.0 ml甲醇溶解代谢物：发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层使用旋转蒸发仪分别减压蒸馏、浓缩干燥后，用2．0 ml甲醇溶解代谢产物。

水稻放线菌的分离

1样品的采集---与真菌一样

2 培养基

3水稻内生放线菌的分离

样品表面消毒方法参考阮继生等(1990)分离弗兰克氏菌和Coombs J．T．(2002)分离小麦根内生放线菌采用的方法。将采集的水稻根、茎叶样品在流水下冲洗，除去表面附着的尘土与泥沙，晾干。剪成小段一70％的乙醇溶液浸泡5 min----O．87％NaCLO溶液(漂白粉)浸泡10 min--10％无菌的NaHC03溶液浸泡10 min，这样能破坏样品表面结构并抑制内生真

菌的生长。取出晾干后将样品剪成1 cnl长的片段，各处理均随机选取100个片段铺于S培养基(1．O％琼脂)的平板上，26．28℃条件下培养。长出的放线菌菌落经过纯化后保存于S 斜面上。S培养基融化倒平板时分别加入25 ppm高锰酸钾和15ppm奈啶酮酸以抑制真菌和其它细菌的生长。

表面消毒效果检查，参考宋子红等(1999)的方法进行。另外采用了Schulz etal．，(1993) 的存活试验方法观察表面消毒效果。

2放线菌的形态鉴定

采用埋片培养法：将高氏一号合成培养基平板(内生放线菌用)中间平行开两道槽，将放线菌沿槽边缘接种，将灭菌的载玻片沿与槽垂直方向贴在平板上，26℃培养，一周后取下载玻片在显微镜下观察，按《放线菌分类与鉴定》(阎逊初，1992)鉴定至属，重要菌株通过16S rDNA序列分析确定种类。

3内生放线菌的验证及其在植物体内的分布

回接分离试验：将分离到的内生放线菌接种于YEME液体培养基中，27℃振荡培养三天，用此菌液接种水稻无菌组培苗的根部，培养10．14 d后，参考曹理想等(2003)方法，表面消毒后从幼苗的根、茎、叶中再次分离该内生放线菌，以验证其确实属于水稻内生菌。

扫描电镜观察：以戊二醛固定剖开的水稻幼苗根、茎杆和叶片4h以上；PBS冲洗4次，每次20min；30％酒精、50％酒精、70％酒精、90％酒精依次15min；100％丙酮(加无水CaCl2)二次，每次15min,醋酸异戊酯(加无水CaCl2)二次，每次15min。前处理后利用扫描电镜观察被接种水稻植株中内生菌的定植及分布情况。

水稻细菌的分离培养

1样品的采集

采集水稻苗，用自来水清洗整个幼苗。取茎和叶晾干后将其剪成4一5cm长的小段放入灭菌烧杯中，先用75%乙醇浸泡5min，后加入0.2%升汞溶液（或酒精浸泡10 m i n 、升汞8 m i n处理后的消毒灭菌效果最佳）置烧杯于磁力搅拌器上搅动消毒5min或8min，然后加入无菌水，磁力搅拌器搅动清洗，洗涤5次，每次5min。把处理好的材料放到己灭菌的研钵中，加入适量无菌水，充分研磨材料，使其成黏糊状。而后取200uL上清液涂布于LB平板上，37℃恒温培养2一3d。表面消毒是否完全。

取最后一次清洗的无菌水涂布平板以验证消毒是否完全。

依据水稻组织不同生长期，水稻根用0.2%的升汞消毒10min,12min理条件同上。挑取平板上长出的单菌落，经纯化后的内生细菌用含25%甘油的LB液体培养基,—70度保存备用。

2 菌种鉴定

内生菌种类鉴定镜检: 菌种鉴定, 用革兰氏染色先观察菌种形态, 然后是芽孢染色( 孔雀绿染色法) 。镜检依据芽孢杆菌的菌落形态: 圆形或不规则, 灰色或乳白色直杆状, 成对或链状排列; 芽孢: 椭圆、卵圆、圆形或柱形, 芽孢染色后呈绿色, 菌体和芽孢囊呈微红色。棉花内生菌的鉴定。主要参照‘一般细菌常用鉴定方法‘、’常见细菌鉴定手册‘、’微生物试验技术手册‘和’伯杰氏细菌手册‘。