基因克隆的载体系统

4.1.2.4 影响质粒DNA产量的因素 （1）寄主菌株的遗传背景 （2）质粒的拷贝数及分子大小 （3）实验操作误差
4.1.3 质粒载体的构建及类型 4.1.3.1 天然质粒的局限性 天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分子 量、拷贝数等等很多方面不能满足基因克隆的要求，所以绝 大部分质粒载体是在天然质粒的基础上根据基因工程的需要 而改造而来的。 4.1.3.2 质粒载体必备的条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因（理想情况下2种抗性基因） 3、具有若干个限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数
② 环丝氨酸富集法 环丝氨酸是氨基酸类似物，如果在细胞生长分裂过程中 参入到新合成的蛋白质多肽链，则会导致细胞的死亡。因此， 在含有四环素的培养基中环丝氨酸只能杀死生长的Tetr细胞， 而对于停止生长的Tets细胞则无致死效应。
环丝氨酸富集法 由tetr基因内 带有插入序列的 重组质粒所转化 的大肠杆菌细胞， 在含有氨苄青霉 素的培养基初步 筛选以后，经过 一次环丝氨酸处 理，存活的细胞 中Tets细胞所占 比例得到明显的 提高，再经若干 次重复处理， Tets细胞的富集 则可上升数倍。
4.1.1.5 质粒的不亲和性（不相容性） 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质 粒，不能在同一个寄主细胞内稳定地共存的现象。 彼此间不亲和的质粒属于同一个不亲和群；而彼此间能 够共存的质粒属于不同的不亲和群。
质 粒 不 亲 和 现 象 的 图 解
4.1.2 质粒DNA的分离和纯化 为了在基因克隆中用作载体分子，要获得批量的纯化的 质粒DNA分子。加入溶菌酶或SDS（十二烷基硫酸钠）来裂 解大肠杆菌细胞，在从细菌细胞内分离得到质粒DNA，然后 在进一步纯化质粒DNA，使其没有细菌染色体DNA片段、 RNA、蛋白质等杂质的污染。 4.1.2.1 碱变性法 原理：在pH12.0~12.5范围内，线性DNA分子会被变性， 成为线性单链分子；而质粒cccDNA的互补的两条链仍会紧密 地结合在一起。在酸中和时，质粒DNA分子的两条链的复性 迅速而准确，而随机断裂的线性DNA分子复性不会那么快速 而准确，它们聚集成网状结构，在下一步的离心分离时与变 性的蛋白质与RNA一道沉淀下来，滞留在上清液中的质粒 cccDNA用酒精或异丙醇等试剂沉淀收集。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4.1.1.4 质粒DNA的复制类型 质粒拷贝数：（1）生长在标准的培养基条件下，每个 细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目；（2）对应于每条细 菌染色体平均具有的质粒DNA分子数目。 严禁型质粒和松弛型质粒 严禁型质粒：低拷贝数的质粒，每个寄主细胞仅含有 1~3拷贝； 松弛型质粒：高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高 达10~60份 质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之 间有一定的相关性：接合型质粒由于具有较高的分子量，一 般属于严禁型的；而非接合型质粒往往具有较小的分子量， 一般属于松弛型质粒。
（2）F质粒及起接合转移：详见遗传学相关内 容
4.1.1.3 质粒DNA的迁移作用 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程 ColE1质粒的迁移： 2个相关基因： bom：ColE1 DNA 上的特异位点，是 Mob基因产物的作 用位点； mob：其产物是 ColE1 质粒特有 的弥散产物—核 酸酶，作用于 bom位点。
§4 基因克隆的载体系统
4.1 质粒（plasmid）载体
大肠杆菌主要的天然质粒类型： ① F 质粒：致育因子或性因子 ② R 质粒：抗药性因子 ③ Col 质粒：产生大肠杆菌素因子 基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人 工改造而成的。质粒载体是重组DNA研究中最常用的也是最 重要的基因克隆载体。
4.1.1 质粒的生物学特性 4.1.1.1 质粒DNA及其构型 绝大多数质粒都是环状双链DNA分子 质粒DNA的构型：
SC 构型：由cccDNA呈现超螺旋而形成；
OC 构型：开环DNA（ocDNA）的构型； L 构型：双链断裂而形成的线性质粒 DNA分子。
4.1.1.2 质粒DNA的转移 （1）质粒的类型 接合型质粒：能够自主转移的质粒。 非接合型质粒：不能自主转移的质粒。
4.1.3.3 质粒载体的选择性标记 （1）负选择标记
（2）正选择体系 ① 丧失四环素抗性标记的正选择体系 具有四环素抗性标记的细胞对亲脂的螯合剂—萎蔫酸极 其敏感，因此能够在含有萎蔫酸的培养基中生长的只能是四 环素敏感的细胞，而不是四环素抗性的转化子。 将外源DNA片段克隆到载体的四环素抗性基因（tetr）内 某个限制位点上，使后者发生插入失活，并使用含萎蔫酸的 培养基进行正选择。这样获得的抗药性群体全都可能含有插 入的外源DNA片段。
简要操作过程（投影） 4.1.2.2 微量碱变性法 如果质粒DNA需求量不多的情况下（或高拷贝质粒）可 采用此种方法。此方法具有快速简便、经济实惠等优点，还 可以同时抽提几种质粒DNA。方法同大量提取法相近。 4.1.2.3 氯化铯（CsCl）密度剃度离心法 如果实验需要高纯度、高质量的质粒DNA，可采用这种 方法离心纯化质粒DNA 。由于在离心管中还要加入溴化乙锭 溶液，所以也叫氯化铯-溴化乙锭密度剃度离心法。 在超速（或高速）离心状态下，氯化铯在离心管中形成 密度剃度，而细菌裂解液或质粒溶液中的不同成分按其密度 在氯化铯的不同密度层面分离存在，从而达到分离纯化的目 的。
4.1.3.4 质粒载体的类型 ⑴ 高拷贝数的质粒载体
在没有蛋白质合成的条件下仍能复制，具有低分子量、高拷贝 数的特点。在基因工程中用于分离大量的高纯度的克隆基因DNA片 段。通常选用Col1、Pmb1或它们的派生质粒。 通常采用的方法是：在处于对数生长晚期的含有Col1一类质粒 的大肠杆菌培养物中，加入氯霉素或壮观霉素等蛋白质合成抑制剂， 此时细菌染色体DNA的复制被阻断，而质粒DNA的复制不受什么 影响，再继续培养10~12h后，每个细胞内的质粒拷贝数则可扩增 到1000~3000个之多，这样就可以用较少量的大肠杆菌培养物获得 大量的质粒DNA。