饲料中有毒有害物质的测定

黄曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄积性——饲料产品质量控制中的必检项目。
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二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定（P288）
(二)检测方法
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）
限量标准草案。

测定方法灵敏度的提高，对于某些有毒有害物质限量的规定将可能发生改 变。

新饲料资源的开发利用。
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一、概述
（四）饲料中有毒有害物质的分类
1. 按来源分：
天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制剂等 次生：微生物次生代谢产物，如黄曲霉毒素B1、由氨基酸产生的组胺、
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（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入 酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
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黄曲霉毒素B1酶联免疫竞争检测法
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黄曲霉毒素B1分子
样品
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微孔表面情况
AFB1抗体
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标准品
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标准溶液
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酶标抗原
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酶标抗原
酶
AFB1
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特点：
很强的特异性：建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上。
很高的灵敏度：酶催化反应。对于黄曲霉毒素B1，ELISA法 最低可检出0.1μg。
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二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测
量标准为无机砷，造成了使用有机砷添加剂的配合料，含砷量超 过我国国家允许量标准，这也使得检测结果无法依据产品卫生标
准进行质量判定。
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二、饲料中 总砷的测定
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二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定
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洗涤5次，间隔2分钟
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加入酶催化反应底物
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加入反应底物A和B
孵 育 15 分 钟
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显
色
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酶联免疫吸附法
ELISA最常用的四种方法：
直接法测定抗原； 间接法测定抗体； 双抗体夹心法测定抗原； 竞争法测定抗原。
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（1） 直接法测定抗原 A. B. C. 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； 加底物。底物的降解量＝抗原量。
定方法中有3种必要的试剂：
固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体，
酶作用的底物。
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酶联免疫吸附法
A、抗体
将某种抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原 刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体 是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。
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Biblioteka Baidu
单克隆抗体是 由生长在细胞 培养物中的同 一B细胞的群体 （一个克隆） 合成并分泌的、 均一的、识别 同一抗原表位 的抗体。
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酶联免疫吸附法
B、酶与底物：
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚
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一、概述
（三）饲料卫生标准——强制性国家标准
对饲料中有独有害物质及有害微生物以法律形式做出的
统一规定。

1991年版《饲料卫生标准》： 覆盖面较小，造成许多事故纠纷无判定依据，一些 重要的产品卫生指标没有规定等。
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饲料中有毒有害物质的测定
黎观红 江西农业大学动物科技学院
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一、概述
（一）饲料质量


营养质量：饲料营养成分含量；
技术质量：饲料的物理特性、如颗粒大小、形状、硬度、适口性 等、混合均匀度；


卫生（安全）质量：对动物、人和环境的安全；
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一、概述
（三）饲料卫生标准——强制性国家标准

2001年新版GB13078－2001《饲料卫生标准》：
有害物质及微生物卫生指标项目增加了“铬”在皮革、蛋白粉和鸡、猪配合 饲料中的允许量指标。即由原标准规定的16项，修订为17项。 新版标准覆盖的产品品种达66种，是原标准的3倍多。 砷在磷酸盐产品中的允许量指标由每千克产品10毫克，修订为20毫克。 氟在磷酸氢钙产品中的允许量指标由每千克2000毫克，修订为1800毫克。 黄曲霉毒素B1指标将肉用仔鸡配合饲料分为前期料和后期料，其允许量分 别为每千克饲料中10微克和20微克。
1999年1月15日以来，比利时、荷兰、法国、德国相继发生因动物 饲料被二恶英污染，导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二恶英事 件。

“瘦肉精”中毒问题、“毒奶粉（2008）”、“红心鸭蛋（使用 苏丹红，2006）”、“多宝鱼（药物残留，2006）”等。
“配合饲料有毒”、“配合饲料生产的肉蛋奶不能吃”、“小孩 肥胖原因是吃了含激素的肉”。
快速筛选法
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二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定
酶联免疫吸附法 1、原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应 为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。
有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基 联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终
止酶反应。
碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。
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（2）间接法测定抗体 A. B. C. 将抗原吸附于固相载体表面； 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体；
D.
加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。
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（3）双抗体夹心法测定抗原 A. B. C. E. 将抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体; 加底物。底物的降解量＝抗原量。
有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基 联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终
止酶反应。
碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。
补充规定了与各项指标相对应的试验方法，消除了原标准没有指明特定试验
方法的缺陷。
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一、概述
（三）饲料卫生标准——强制性国家标准

现行的饲料卫生标准将进行不断的修订和完善！
相对于发达国家的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准项目偏少。 新农药的不断出现（现行饲料卫生标准只规定了两种农药的限量标准：六 六六、滴滴涕）。敌敌畏 、敌百虫 、甲胺磷 、菊酯类 、马拉磷 、蚜螨磷安全
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二、饲料中总砷的测定
有机砷饲料添加剂：对氨基苯砷酸（阿散酸）、对氨基苯砷酸钠
和3-硝基-4-羟基苯砷酸 （洛克杀生 ）。
促生长，抗球虫及着色（使皮肤红润，毛色发亮）等功效。 我国制定的饲料中砷测定标准方法是测定饲料中总砷含量（目前
的检测方法还不能区分有机砷和无机砷），而卫生标准中砷的限
情绪质量：伦理标准或感觉可影响对质量的讨论， 如有争议的动 物性原料 或人造着色剂和调味剂。 公众对饲料质量重要性的认识的变化 表1
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一、概述
（二）几起典型的饲料安全事故


２０世纪８０年代中期至９０年代中期疯牛病（“牛海绵状脑 病” ）的暴发流行。
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酶联免疫吸附法
B、酶与底物：
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚
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反
应 孔
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阴 性 对 照 孔
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阴性对照孔=没有黄曲霉毒素B1分子与酶标抗原竞争 所有抗体都与酶标抗原结合
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阳 性 对 照 孔
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1 ng/ml 标准孔 = 黄曲霉毒素B1分子结合到抗体上 剩余的抗体再与酶标抗原结合
（一）概述
黄曲霉毒素（aflatoxins, AF）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一 组化学结构类似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其饼粕等。对 人和动物均具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素还可在动物产品中蓄积， 影响人体健康。 目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、 GM、B2a和毒醇。其中黄曲霉毒B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。 在自然条件下，饲料污染的黄曲霉毒素主要为AFB1、B2 、G1 、G2，其中 以AFB1含量最高。
砷的毒性：砷与动物体组织中酶的巯基结合使之失活，
损害机体全身组织。
砷的氧化物毒性很高，三价砷毒性>五价；无机砷毒性 >有机砷：砒霜（As2O3 ）。 一般情况下，植物性饲料砷含量很低。 植物饲料中砷含量与土壤中的水平、农药污染和工业污 染有关。
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饲料安全等于畜产品安全！
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都是药残惹的祸！
疯牛病 二恶英 瘦肉精 三聚氰胺 苏丹红（红心鸭蛋） 孔雀石绿（水产品） 抗生素等药物残留 ……
三聚氰胺
苏丹红
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“土鸡”
“饲料鸡”
新概念鸡蛋全是“扯蛋”？
尸胺、腐胺、精胺等
外源性：重金属污染，
2 按性质分：
有机：棉籽饼粕、菜籽饼粕、蓖麻饼粕中的蓖麻毒素和蓖麻碱、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制剂等，病原微生物、 霉菌毒素、有机农药等。 无机：铅、砷、铬、镉、汞、氟、钼等。
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二、饲料中总砷的测定（P248）
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标准品, 样品 和 酶标抗原 加进微孔
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先 加
样
样品
品
孔
后 加
酶标抗原
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标
先 加
准
孔
酶标抗原
后 加
标准品
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孵育30分钟 抗原与抗体结合
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微孔清洗