植物病毒病的诊断与鉴定

7.二十面体的核酸与蛋白亚基的排列
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3.植物病毒病的症状特征
一、外部症状(Symptom)： • 病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现为变色、畸形，少
数引起坏死、腐烂，萎蔫极少发生。 • 变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。 • 坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏
物学方法可以区分在遗传信息上一个核苷酸或者蛋白质中一个氨 基酸的变异，因此生物学实验是其它实验方法所不可取代的。
• 生物学实验中应用最多的是鉴别寄主，即用来鉴别病毒或其株系 的具有待定反应的植物。
• 凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可 作为鉴别寄主。
• 组合使用的几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中 一般包括可系统侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。 如若区分经常出现的黄瓜花叶病毒属的三个成员，采用表4—1的 鉴别寄主。
• TMV为棒状，CMV球状的。 • 球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60
个或60的倍数，蛋白质亚基在每个面 上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒 体中心也是空的。核酸链排列还不清 楚。
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2.3植物病毒的组成
• 植物病毒主要成分是核酸和蛋白质，核酸在内部，外 部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有 少量的糖蛋白或脂类。
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3.植物病毒病的症状特征
三、患病植物的生理变化： 表现为： ①病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。 ②碳水化合物含量下降。 ③淀粉在叶部积累引起黄化。 ④多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性增强，使细胞中毒坏死。 ⑤光合作用下降，破坏了寄主的叶绿素。 ⑥植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。
• 类病毒(viroid)在命名时遵循相似于病毒的规则，因缩写名易 与病毒混淆，新命名规则规定类病毒的缩写为Vd，如马铃薯 纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)缩写为PSTVd。
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2.植物病毒的形态、结构与组成 2.1植物病毒的形态
死枯斑，马铃薯Ｙ病毒的某些株系侵染烟草可产生脉坏死。 • 畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll) ，皱叶 (rugose)，蕨
叶 (fernleaf)。 刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。
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叶病，如油菜花叶病和TMV。 • 隐症：已经表现病毒病症状的植株，由于环境条件改
变，症状消失的现象。这种隐症在条件合适时又可重新 表现症状。 • 隐症：条件不同。 潜伏侵染：寄主不同。 （2）光照：过强、过弱都会影响症状的表现。多数在光弱 时花叶病症状容易表现，接种易成功
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• 原生 生 物
＋
＋
＋
＋
•细
胞
＋
－
－
＋
• 线粒体和叶绿体 ＋
－
－
－
•膜
＋
－
－
－
染色体、质体含核酸 －
－
－
－
•病 毒
－
－
－
－
•
综上所述，认为病毒是有机物，而不是生物。
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1.植物病毒的概述
植物病毒的命名
• 植物病毒的名称目前不采用拉丁文双名法，仍以寄主英文俗 名加上症状来命名，如烟草花叶病毒为Tobacco mosaic virus， 缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumber mosaic virus，缩写为 CMV。
• 还有少数病毒与以上形态不同，它们有的看上 去是两个球状病毒联合在一起，被称为双联病 毒(或双生病毒)；有的像弹头，被称为弹状病毒； 还有的呈丝线状，柔软不定形。
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2.2植物病毒的结构
• 中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多 蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基 均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒的 粒体是空心的。
• 属名为专用国际名称，常由典型成员寄主名称(英文或拉丁文) 缩写十主要特点描述(英文或拉丁文)缩写十virus拼组而成。如： 黄瓜花叶病毒属的学名为Cucu—mo—virus；烟草花叶病毒属 为Toba—mo—virus。即植物病毒属的结尾是一virus，科、属 名书写时应用斜体，而种和株系的书写不采用斜体。
病毒（viroid); • 1982年发现仅有蛋白质的月元病毒
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1.植物病毒病的概述
植物病毒学研究历史：
• 1981年，A.Lwoff在巴黎举行的第五届病毒学大会上， 这一法国病毒研究所所 长阿尔．沃夫，认为病毒不是生物，他的观点如下：
•
生长和分裂 独立进化 独立的生命体 活的
• 构成病毒的成分：核酸5--40%，蛋白质60-95%，还有 水分和矿物质等。
• 类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应， 真病毒有专化性血清反应。
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植物病毒主要类型
1.长而弯曲的线状粒体 2.僵直的杆状粒体 3.示杆状或线状病毒核酸与 蛋白亚基的排列 4.杆菌状粒体 5. 杆菌状粒体横切面 6.多角体病毒粒体
•
马铃薯Ｘ病毒 轻微斑驳
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3.植物病毒病的症状特征
2. 寄主因素：
①一种病毒在不同寄主上可表现不同症状。
•
如： TMV 普通烟──全株型花叶症状
•
心叶烟──局部性坏死枯斑
②潜伏侵染：一种病毒感染某些植物后，可以侵染但不表现症状 的现象。 如：小麦黄矮病毒在除小麦之外的禾本科作物上不 表现症状。 ③同一种病毒侵染同种寄主的不同品种上表现不 同：
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3.植物病毒病的症状特征
四、症状变化：
一种病毒引起的症状可因病毒、寄主和环境三方面的因素而改变。
1.病毒本身：
①病毒的株系(Strain)：同一种病毒在致病性上也有差异，也称为病毒的 生理小种，为了便于与真菌生理小种的区别，称为株系。有强株系(症 状表现明显，危害较大)和弱株系(症状不太明显)。
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1.植物病毒病的概述
植物病毒学研究历史：
• 1936年英国科学家鲍登(Bawden)证明提纯的TMV中含 有核酸；
• l939年Kausch通过电子显微镜观察到植物病毒的形态； • 1956年Gierrer 证明去掉蛋白质的RNA起重要侵染和
繁殖作用； • 1971年Diener 发现了很小的RNA（250-400bps)称为类
如：TMV(弱株系)
番茄 花叶或斑驳
•
TMV番茄条斑株系(强株系)
坏死，条斑
•
TMV弱株系侵染烟草引起轻微斑驳，强株系则引起严重花叶。
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TMV（烟草花叶病毒） 23
3.植物病毒病的症状特征
• ②交互保护作用(cross protection)：同一种病毒的弱株系先接种 植物后，就可以保护寄主免受病毒强株系的严重伤害，即先侵 染的病毒可以保护植物不再受亲缘关系较近的另一种病毒的侵 染。
• a.抗病品种：产生局部枯斑反应。TMV──心叶烟。
• b.高抗或免疫品种品种：病毒侵入后增殖量很少或不能增殖。
• c.耐病品种：侵染寄主后可大量繁殖，但表现症状很轻微， 这与真菌耐病性不同。
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3.植物病毒病的症状特征
3. 环境因素：环境因素可抑制或改变症状的表现。 （1）温度：〉35℃或〈10℃病害症状轻微，特别是对于花
结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别的还有皿状， 无色透明，主要是由病毒粒体和寄主的蛋白质有规则地排列形成。 Ｘ－体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒粒 体和寄主物质构成
内含体的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作为一种诊断 的指标。 ②但并不是所有的病毒病都有内含体，有些必须发育到 一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体，因此， 单靠内含体诊断还有一定的局限性。
• 病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指通 过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显 示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相 比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前广泛用于生物大分子、 细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免 疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究 所必不可少的一 项技术。
• 常用的方法有生物学实验、血清学检测 和电子显微镜观察等。
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一、生物学实验
• 生物学实验的目的是确定病原的侵染性，用实验方法证明病毒与 病害的直播方式，明确病毒所致病害的症 状类型和寄主范围。在分子生物学技术尚欠发展的过去，只有生
1.植物病毒病的概述
植物病毒学研究历史：
• 1886年梅耶尔(Mayer)证明了烟草花叶病害的摩擦传染性; • 1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发现了烟草花叶病的病原可以
通过细菌过滤器； • 1898年伯吉林克(Beijeincku)又发现该病原不是微生物，而是一
种传染性活液 ( contagium vivum fluidum )，这就是Virus一词的 来源； • 1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）获得了烟草花叶病毒的 蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖的蛋白（1946年获 Nobel Prize in Chemistry)。
•
如果两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。
• ③拮抗作用和协生作用：
• 拮抗作用：一种病毒侵染寄主植物后，可抑制另一种病毒再
对植物的侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃 薯Ｙ病毒对烟草的侵染。
• 协生作用：两种病毒侵染一种寄主植物后，可使症状比单独 侵染时更为严重，加剧为害。
如：番茄花叶病毒 轻微斑驳 > 番茄 坏死
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3.植物病毒病的症状特征
2. 细胞的变化： 花叶和斑驳是由于细胞内叶绿素遭到破坏所致。
内含体(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的 一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下可以观察 到。分为不定型内含体Ｘ－体和结晶体。
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花叶（变色界限明显）
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叶片卷曲
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3.植物病毒病的症状特征
二、 病组织的内部和细胞的变化： • 1. 组织变化： • 组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引起薄
壁组织坏死，有些引起茎部维管束和叶部坏死，烟草花 叶病毒侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。一般引起黄化类 型的病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。 • 组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生 激素，引起增生。
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鉴别寄主 花生 菊花 黄瓜
表4-1 黄瓜花叶病毒属三种病毒 在鉴别寄主植物上的症状反应
黄瓜花叶病毒 花生矮化病毒 番茄不孕病毒
无病症
褪绿，矮花叶
无症状
不侵染
？
侵染
花叶
花叶
无花叶
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二、电子显微镜技术
• 与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子 流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l 0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。 但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10~100nm之间。所以电镜 观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。
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4.植物病毒的鉴定
• 植物病毒的分类是将已知病毒按一定标 准、相似程度或相关性的顺序排列，拼 成一个系统，即分类系统。
• 植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病 毒在分类系统中的地位，由于植物病毒 个体微小，结构简单，对寄主的依赖性 强，鉴定工作难度大，技术性强，对工 作条件的要求高。
• 鉴定植物病毒过去大多采用病毒间生物 学特性的差异，如所致症状类型、传播 方式、寄主范围等；现在则增加了病毒 核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方 面的方法。
• 观察需要电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。
• 植物病毒的基本形态为球状、杆状和线条状。
• 球状病毒的直径大多在20一35nm，少数可以达 到70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二 十面体(icosahedral particle)病毒。
• 杆状病毒多为20-80nm×100-250nm，两端平齐； 少数两端钝圆，线状病毒多为11—13nm × 750nm，个别可以达到2000nm以上。